Génération de l'homme CD40-B activés cellules

Résumé

Dans cette vidéo, nous présentons les Ex vivo et l'expansion des cellules B CD40-activées (CD40-B) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par stimulation par CD40 ligand et l'interleukine-4.

Résumé

CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été identifiés comme une source alternative de l'immuno-stimulation des cellules présentatrices d'antigènes (APC) pour l'immunothérapie du cancer ^1-3. Comparé aux cellules dendritiques (CD), la meilleure APC caractérisée, les cellules CD40-B ont plusieurs propriétés biologiques distinctes et techniques. Similaires aux PED, les cellules B montrent une augmentation de l'expression du CMH et des molécules de co-stimulation (Fig. 1b), présentent une forte capacité migratoire et la présentation des antigènes présents efficacement aux cellules T, après stimulation par un ligand interleukine-4 et CD40 (CD40L). Cependant, contrairement aux CD immatures ou matures, les cellules CD40-B expriment la triade lymphatiques pleine noeud homing composé de CD62L, CCR7/CXCR4, et la fonction des leucocytes antigènes-1 (LFA1, CD11a/CD18), nécessaires à tête chercheuse d'organes lymphoïdes secondaires (Fig.1a) ^3. Cellules CD40-B peuvent être générés sans difficultés à partir de très petites quantités de sang périphérique qui peut être élargi in vitro à de très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (> 10 ⁹ cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que le cancer patients (Fig.1c, d) ^1,4.

Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé CD40-B à partir des cellules PBMC humaines. Molécules clés pour la culture cellulaire sont CD40-ligand, l'interleukine-4 (IL-4) et la cyclosporine A. (CSA), qui sont reconstituées dans un cycle de culture de 3-4 jours Aux fins de laboratoire CD40-stimulation est fournie par des cellules exprimant NIH/3T3 humaine recombinante ligand CD40 (tCD40L NIH/3T3) ^5. Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l'expression du ligand CD40 humaine sur les transfectants doit être vérifié régulièrement (Fig.2).

Après 14 jours de CD40-B cultures cellulaires consistent de plus de 95% de cellules B pur et une expansion des cellules CD40-B de plus de 65 jours est souvent possible sans aucune perte de fonction ^{1, 4.} Cellules CD40-B efficacement relever, traiter et présenter les antigènes aux cellules T ^6. Ils ne sont pas seulement naϊve écoute, mais également d'élargir les cellules T mémoire ^7,8. CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B, la différenciation et la fonction. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs ^9.

Protocole

Le protocole pour la génération des cellules B CD40 humains activés à partir des PBMC est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation du ligand CD40 exprimant cellules NIH/3T3, qui sera utilisée comme plaque de cellules nourricières lié. Partie B décrit les réelles CD40-B de la culture.

A. Préparation de cellules nourricières (tCD40L NIH/3T3)

Le NIH/3T3 tCD40L est une adhérente lignée murine de cellules fibroblastes, qui ne devrait jamais devenir complètement confluentes. Les cellules sont donc découpé deux fois par semaine. La culture sur plus de six semaines n'est pas recommandée.

Matériaux

A. Préparation des médias:

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules nourricières type de support sauvages	Milieu de sélection de cellules Feeder
Réactifs	Concentration	Réactifs	Concentration
DMEM-Ham / F12		DMEM-Ham / F12
L-Glutamine	365 pg / ml	L-Glutamine	365 pg / ml
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycine	15 ug / ml	Gentamycine	15 ug / ml
		G-418	0,7 mg / ml

CD40-B milieu de lavage	CD40-B milieu de culture
Réactifs	Concentration	Réactifs	Concentration
IMDM		IMDM
L-Glutamine	584 pg / ml	L-Glutamine	584 pg / ml
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycine	15 ug / ml	Gentamycine	15 ug / ml
		rh transferrine	50 ug / ml
		L'insuline rh	5 ug / ml
		AB-Humanserum	10%

B. Réactifs Divers:

Réactifs	Société	Ordonnance n
DMEM / Ham F12	AAP	Pas de chat: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco ®	REF 21980-032
Dulbecco PBS (10x)	AAP	Cat No H15-011
AB-sérum humain	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-transferrine humaine	Sigma	Aucun chat T0665
Insuline humaine	Sigma	Aucun chat I2643
Gencin ®	Sélectionnez Delta	Art Pas 7395800
Interleukine-4 de l'homme	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporine A	Novartis	Cat No 0078-0109-01 NDC
FBS	LONZA	Aucun chat DE14-802C
Tampon HEPES	AAP	Cat No S11-001
G-418 Sulfate	AAP	Aucun chat P02-012
Trypsine / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco ®	REF 15400-054

C. Fournitures diverses:

Réactifs	Société	Ordonnance n
Stérile pipette	Sarstedt
6-même la plaque	NUNC	Cat No 140675
50mL tube conique	BD Falcon ™	Cat No 352070
Flacon de culture tissulaire	SARSTEDT	Aucun chat 83.1813.002