Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Summary

Ici nous démontrons les protocoles pour effectuer une seule molécule de microscopie par fluorescence sur des cellules vivantes pour permettre aux bactéries fonctionnelles complexes moléculaires à détecter, suivre et quantifiés.

Abstract

Aperçu complet sur les mécanismes de cellules vivantes peuvent être atteints que par l'étude des processus clés qui déclenchent et direct d'événements au niveau cellulaire. À ce jour, la complexité des systèmes biologiques de cisaillement a provoqué précise molécule unique d'expérimentation à être beaucoup trop exigeant, de se concentrer plutôt sur des études de systèmes simples à l'aide en vrac relativement rudimentaires ensemble de la moyenne des mesures. Toutefois, plusieurs processus importants se produisent dans la cellule vivante, au niveau d'un seul ou de quelques molécules; mesures d'ensemble masque généralement la nature stochastique et hétérogène de ces événements. Ici, en utilisant la microscopie optique de pointe et d'analyse des outils d'analyse d'image, nous démontrons comment surveiller les protéines au sein d'une seule cellule vivante bactérienne avec une précision de molécules uniques et comment nous pouvons observer la dynamique au sein de complexes moléculaires dans le fonctionnement des machines biologiques. Les techniques sont directement pertinents physiologiquement. Ils sont peu-perturbatifs et non-invasive à l'échantillon biologique à l'étude et sont entièrement à l'écoute pour des recherches dans la matière vivante, les fonctionnalités ne sont pas facilement disponibles pour les autres une seule molécule des approches de biophysique. En outre, les échantillons biologiques étudiés tous les produits de protéines par fluorescence marqués à des niveaux qui sont presque identiques aux souches de cellules non modifiées («codage» génomique), par opposition à l'approche la plus commune, mais moins idéal pour générer des protéines beaucoup plus que ne se produisent naturellement («plasmide d'expression»). Ainsi, les échantillons biologiques réelles qui seront étudiés sont beaucoup plus près les organismes naturels, et donc la plus pertinente pour les observations réelles des processus physiologiques.

Protocol

1. Pour commencer cette procédure, 50 pl de stocks congelés de la protéine fluorescente Escherichia coli exprimant les cellules bactériennes sont d'abord décongelée et culture aérobie avec agitation dans 5 ml de milieu LB de croissance nuit à 37 ° C. Dans la matinée, 50 pi de cette culture saturée est extrait et sous-culture dans les milieux de culture minimale M63 glucose, l'incubation à 30 degrés C pendant 4 à 6 heures. Ici nous démontrons l'aide de deux souches de cellules différentes, dont l'un exprime un transport d'électrons du cytochrome fusionnée à la GFP, l'autre qui exprime une protéine impliquée dans le moteur flagellaire des bactéries fusionnée à la GFP.
2. ....

Discussion

Des précautions doivent être prises pour ne pas «plus de cisaillement" cellule pour regarder les bactéries attachées, car cela pourrait nuire à la fonctionnalité des moteurs flagellaires. Il est important d'utiliser des cellules pour beaucoup plus d'une heure une fois sur la lame du microscope, car ils peuvent devenir pauvre en oxygène. Optimisation considérables peuvent être nécessaires pour trouver les meilleurs conditions d'imagerie microscope traiteur à votre système biologique spécifique de l'e.......