Un journaliste Roman DP pour faciliter la visualisation du disque Eye Imaginal au Drosophile</em

Résumé

Nous décrivons une nouvelle protéine fluorescente rouge (RFP) journaliste qui est exprimé spécifiquement dans le Drosophile. Nous détaillons une méthodologie pour la dissection du disque imaginal des yeux et comment ce journaliste peut être utilisé pour aider à la dissection et l'identification des types cellulaires spécifiques dans les yeux en développement.

Protocole

1. Première place une goutte de PBS sur un plat Sylgard sous un microscope à dissection.
supprimer plusieurs larves errer troisième stade larvaire à partir d'un flacon ou une bouteille à l'aide d'une spatule et les placer dans le PBS.
2. Pour commencer la dissection d'utiliser votre main gauche une pince à épiler (si vous êtes droitier) de saisir une larve des deux tiers de la voie vers le postérieur et ensuite utiliser l'autre paire de tenir les crochets colorés sombres bouche à l'extrémité antérieure.
3. Maintenant, tirez doucement la larve part en déplaçant les deux paires de pinces loin les uns des autres. Les pièces buccales devraient venir loin du reste du corps avec le complexe des yeux / du cerveau ci-joint.
4. Pour les disques tache oeil pour corriger immunofluorescence les disques à ce point en les plaçant dans du paraformaldéhyde à 4% / solution PBS pendant 30-45 minutes sur la glace. Puis laver les disques à quatre reprises avec PBST et aux taches, puis avec des anticorps appropriés.
5. Il est plus facile à décortiquer les disques oeil directement sur une diapositive. Déposer une goutte de PBS sur une lame et déplacer les disques à la baisse de PBS en tenant l'appareil buccal.
6. Les tissus imaginaux sont translucides et donc au premier abord l'oeil disques sont difficiles à identifier. Pour le rendre plus facile d'identifier les utiliser un microscope à dissection avec la capacité de fluorescence. Utilisation de l'oeil-DP en ligne Reporter les disques œil peut être clairement perçue comme le tissu rouge fluorescent recouvrant les lobes optiques sphériques (figure 1).
7. Si vous utilisez une source de fibres optiques à lumière froide de diriger la lumière à un angle oblique par rapport à la diapositive, comme cela vous donnera des disques plus grand contraste. Les disques des yeux / du antennaires sont attachés à des lobes optiques via le pédoncule optique à l'arrière et à travers les pièces buccales d'une tige à venir à partir du disque antennaire à l'antérieur.
8. Pour disséquer les disques oeil maintenir les pièces buccales en utilisant une paire de pinces et d'utiliser l'autre paire de séparer les disques oeil du cerveau larvaire. Suivant séparer les disques oeil du rostre. Enfin retirer le rostre de la diapositive, car ils peuvent empêcher la lamelle de la position couchée à plat.
9. Quand vous avez disséqué tous les disques yeux délicatement basculer la lame et sécher l'excès de PBS. Puis ajoutez une goutte de Vectashield et placez doucement une lamelle sur le dessus.
10. Les disques sont maintenant prêts à être imagé soit par microscopie à épifluorescence ou confocale (figure 2).

Quand disséqué correctement le disque yeux / antennaire doit être à plat sur la lame libre de tout tissu étranger comme le cerveau. Les pôles dorsale et ventrale du disque yeux sont courbées et tendent ainsi à se plier, mais cela peut être évité en prenant une série Z sur un microscope confocal et en omettant ces sections de la projection. Bien que le disque est un épithélium monocouche des positions variables des noyaux nécessitent une projection de la série Z pour obtenir une image globale du disque. Une projection d'un typique oeil-oeil DP / disque antennaire prises sur un microscope confocal est montré dans la figure 2. Nous prennent habituellement une des sections um à travers le disque en utilisant une lentille 20x ou 40x. Le journaliste oeil-DP est localisée nucléaire et donc la tendance observée dans la figure 2 représente les noyaux des cellules exprimant la DP.

Figure 1. Dissection initiale de l'œil / cerveau de complexes une larve de l'œil-DP troisième stade drosophile. L'œil / disque antennaire imaginale (décrites) peut être vu attaché à l'appareil buccal (MP) et en superposant le lobe optique (LO) du cerveau. L'image a été prise en utilisant un microscope à fluorescence dissection de montrer l'expression DP dans le disque oculaire. Antérieure est à gauche. Barre d'échelle: 300 um.

Figure 2. Expression de la journaliste yeux DP dans le disque imaginal des yeux. Un œil troisième stade (ED) / disque antennaire (AD) disséqué par une larve d'oeil-DP DP montrant l'expression (en rouge). Le disque a été coloré avec la phalloïdine (vert), qui colore la surface des cellules apicales et montre le sillon morphogénétique (flèche). DP est exprimée dans les cellules précurseurs dans le MF, dans les photorécepteurs 1,6,7 et dans les cellules de cône. Antérieure est à gauche. Barre d'échelle: 25 um.

Discussion

Dissection du disque imaginal des yeux chez la drosophile est simple, mais peut prendre du temps à maîtriser. Les étapes essentielles sont l'identification du disque oeil et sa dissection loin du cerveau larvaire. Identification du disque œil est rendue plus facile en utilisant la ligne de l'œil-DP décrites ici. Les modifications éventuelles sont à retirer le disque antennaire ou la membrane peripodial, ou de quitter le lobe optique attaché à visualiser les axones PR entrant dans le cerveau.