Article de méthode

Visualisation de localisation de l'ARN Xenopus Les ovocytes

DOI :

10.3791/1704

⸱

14 janvier 2010

 , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

Dans cet article

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Résumé

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Visualisation des In vivo ARN de transport se fait par micro-injection d'ARN transcrits marqués par fluorescence dans Xenopus Ovocytes, suivi par microscopie confocale.

Résumé

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La localisation d'ARN est un mécanisme conservé d'établir la polarité cellulaire. Vg1 ARNm se localise dans le pôle végétal des ovocytes de Xenopus laevis et agit pour restreindre l'espace d'expression génique des protéines Vg1. Un contrôle strict de la distribution Vg1 de cette manière est requise pour la spécification de la couche germe de bon dans l'embryon en développement. Des éléments de séquence d'ARN en 3 'UTR de l'ARNm, l'élément Vg1 localisation (VLE) sont nécessaires et suffisantes pour le transport direct. Pour étudier la reconnaissance et de transport de Vg1 ARNm in vivo, nous avons développé une technique d'imagerie qui permet une analyse approfondie des facteurs de trans-mécanismes de transport dirigé via une lecture visuelle simple.

Pour visualiser la localisation d'ARN, nous synthétisons marqué par fluorescence ARN VLE et microinject cette transcription dans des ovocytes individuels. Après la culture des ovocytes pour permettre le transport de l'ARN injecté, les ovocytes sont fixes et déshydratés avant d'imagerie par microscopie confocale. Visualisation des schémas de localisation d'ARNm fournit une lecture de surveillance de la voie complète de l'ARN de transport et d'identification des rôles dans la direction de l'ARN de transport pour les éléments agissant en cis au sein de la transcription et facteurs agissant en trans qui se lient à l'VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nous avons étendu cette technique à travers la co-localisation avec des ARN et des protéines supplémentaires (Gagnon et Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), et en combinaison avec perturbation des protéines motrices et le cytosquelette (Messitt et al., 2008) à la sonde mécanismes sous-jacents de localisation d'ARNm.

Protocole

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Partie 1: La transcription de l'ARNm marqué par fluorescence.

  1. Linéariser l'ADN plasmidique contenant l'élément de localisation ou d'autres séquences d'ARN pertinentes et remettre à 1 ug / ul avec DEPC traitées H 2 O. La matrice d'ADN doit avoir des sites promoteur en amont de la transcription par T7, SP6 ou T3 ARN polymérase.
  2. Ajouter les réactifs suivants dans un tube stérile de 1,5 ml:
    a. Tx 10X tampon (voir M & M) 2 pl
    b. 20X CAP / NTP mélanger (voir M & M) 1 pl
    C. 1 mM Alexa Fluor 546 au 14-UTP (Invitrogen) 1 pl
    d. UTP,

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Discussion

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Ici, nous avons présenté un protocole pour la visualisation de la localisation d'ARNm dans les ovocytes de Xénope. Cette méthode, en utilisant des ARN transcrits marqués par fluorescence a plus de signal sur bruit que précédemment obtenus avec marquées à la digoxigénine transcriptions et est plus simple et plus rapide que in situ des approches fondées (Mowry et Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). En utilisant cette méthode, nous pouvons concevoir l'ARN mutations séquence et tester rapidement des f.......

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Déclarations de divulgation

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Des expériences utilisant des animaux de laboratoire ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université Brown.

Remerciements

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Notre travail sur la localisation d'ARN est soutenu par une subvention du NIH (R01GM071049) à KLM.

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Matériaux

10X tampon Tx

  • 60 mM MgCl 2
  • 400 mM Tris-HCl (pH 7,5)
  • 20 mM spermidine-HCl

20x CAP / NTP mélangez

  • 10 mM CTP
  • 10 mM d'ATP
  • 9 mM UTP
  • 2 mM GTP
  • 20 mM G (PPP) G Cap analogique (New England Biolabs)

Colonne G-50

  • Hydratez 5 g de Sephadex G-50 perles (Sigma Aldrich) dans 100 ml d'eau désionisée H 2 O. DEPC traiter pendant 30 min. et autoclave. Magasin de stock incomplète à la température ambiante. Avant utilisation, ajoutez la ligne suivante sans RNase solutions:
  • 0,5 ml d'EDTA 0,2 M
  • 1 ml Tris 1 M pH 8,0
  • 0,5 ml SDS à 20%
  • Boutique complète G-50 une solution à 4 ° C.
  • Retirez et jetez le piston d'une seringue de 3 ml (BD Biosciences) et placer le canon de la seringue dans un tube de 15 ml conique (Corning). Branchez la seringue avec une petite quantité de laine de verre (une prise près de la moitié de la taille d'un penny).
  • Swirl complète G-50 une solution pour remettre perles.
  • Ajouter 2 ml solution G-50 à la colonne vide.
  • Spin pendant 1 minute à 1000 x g dans la centrifugeuse de paillasse.
  • Ajouter 200 ul traitée par DEPC désionisée H 2 O pour chaque colonne. Spin.
  • Répétez laver deux fois plus pour un total de trois lavages.
  • Enlevez seringue à un frais 15 ml tube conique.

Solution de collagénase

  • 75 mg de la collagénase de Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
  • 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4)

MBSH tampon

  • 88 mM de NaCl
  • 1 mM de KCl
  • 2,4 mM NaHCO 3
  • 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X
  • 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O
  • 0,41 mM de CaCl 2 X 6 H 2 O
  • 10 mM HEPES (pH 7,6)

Milieu de culture des ovocytes

  • 50% du milieu L15
  • 15 mM HEPES (pH 7,6)
  • 1 mg / ml d'insuline
  • 100 mg / ml de gentamicine
  • 50 U / ml de nystatine
  • 50 U / ml de pénicilline
  • 50 mg / ml de streptomycine

MEMFA solution

  • 0,1 M MOPS (pH 7,4)
  • EGTA 2 mM
  • 1 mM MgSO 4
  • Formaldéhyde 3,7%

Informatique ARN rendement

  • Déterminer CPM dans "entrée" et "incorporé" des échantillons en utilisant un compteur à scintillation standard.
  • l'incorporation = («incorporée») / (10 x '"entrée")
  • Les valeurs habituelles se situent entre l'incorporation ~ 0,03 et 0,10.
  • Rendements maximums théoriques pour polymérases différentes:
    T7, T3, SP6 - 2,64 g
  • Rendement de la réaction en pg = (rendement maximal de la polymérase utilisée) X (constitution)
  • Diluer l'ARN à 50 nM = (g ARN) / 320 / (longueur de l'ARN dans des bases) / (5X10 -8)
  • La réaction généralement des rendements de 50 à 100 ~ ul d'ARN à 50 nM.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gag....

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

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Mots-clés

ARN fluorescentMicroinjectionMicroscopie confocaleARNm Vg1ARN VLECulture d ovocytesFixation d shydratationProt ines motrices

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