La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d'hôte

Résumé

Procédure pour la fertilisation Ovocytes de Xenopus Par la méthode de transmission de l'hôte.

Résumé

Etudier l'apport de molécules hérité de la mère au développement précoce des vertébrés est souvent entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour produire des animaux mutants à effet maternel. De plus, de nombreuses techniques pour surexprimer ou inhiber la fonction des gènes dans des organismes comme le poisson-zèbre et le xénope ne parviennent pas à suffisamment cible critique maternelle voies de signalisation, tels que la signalisation Wnt. Chez le xénope, la manipulation de la fonction des gènes dans les ovocytes en culture et par la suite les fertiliser peut améliorer ces problèmes dans une certaine mesure. Les ovocytes sont manuellement defolliculated à partir de tissus d'ovaire donateurs, injecté ou traité dans la culture comme souhaité, et ensuite stimulées avec de la progestérone pour induire la maturation. Ensuite, les ovocytes sont introduits dans la cavité du corps d'une grenouille hôte ovulation féminine, après quoi ils seront transporté dans l'oviducte de l'hôte et l'acquisition des modifications et des manteaux de gelée nécessaires à la fécondation. Les embryons ainsi obtenus peuvent ensuite être porté à la scène désirée et analysées pour les effets de toute perturbations expérimentales. Cette méthode de transfert de l'hôte a été très efficace dans la découverte des mécanismes de base du développement précoce et permet un large éventail de possibilités expérimentales ne sont pas disponibles dans tous les autres vertébrés organisme modèle.

Protocole

1. Ablation chirurgicale du tissu Ovaire

1. Préparer un nouveau lot de milieu de culture des ovocytes (OCM; Matériaux), entre 400 à 800 ml selon la taille de l'expérience. Ajuster le pH de 07.06 à 07.08, jusqu'à ce que le rouge de phénol vire au rouge foncé (six ou si de petites gouttes de NaOH 5N). Verser une petite quantité de vérifier le pH dans un tube séparé depuis l'électrode pH peut contaminer les médias. OCM doit être conservé à 18 ° C et utilisée dans une semaine.
2. Sélectionnez 3-5 femelles et placer une solution dans ~ 2L anesthésie tamponnée (Matériaux). Nous essayons d'éviter d'utiliser des grenouilles q....

Discussion

Un transfert réussi aboutira à la fécondation et de clivage normal de> 50% des ovocytes (Figure 3). Généralement entre 30-60% des ovocytes transfert va survivre dernières étapes neurula. Nous transfèrent habituellement de 75 à 150 ovocytes par groupe expérimental, ce qui donnera suffisamment d'embryons pour plusieurs types d'analyses (in situ, RT-PCR) ainsi que la visualisation du phénotype. L'implantation d'ovocytes nettement plus ne semble pas augmenter considérablement le rendement. En outre, au mo.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
70% Leibovitz milieu L-15 (contenant de la L-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA; fraction V)	(Sigma A-9418-50g)
1x pénicilline-streptomycine	(Sigma P-0781)
Ajuster le pH à 7.6 au 7.8 avec NaOH 5N
Faire frais hebdomadaires, stocker à 18 ° C.

NaCl 1M

20 mM de KCl

20 mM de CaCl2

MgCl2 10 mM

150 mM d'HEPES

ajuster le pH à 7.6 au 7.8

Conserver à 4 ° C

1 g / L 3-aminobenzoïque ester éthylique d'acide (MS222)	(Sigma A-5040)
Bicarbonate de sodium 0,7 g / L
Dissoudre dans l'eau traitée Amquel
Faire frais hebdomadaires

10 mM de progestérone (Sigma P-0130) dans l'éthanol à 100%

Diluer à 1 mM dans EtOH à 100% pour un stock 500x / solution de travail

Conserver à -20 ° C

Bleu: 0,1% du Nil Bleu Une	(Aldrich 121 479-5G),
Rouge: 0,25% Rouge Neutre	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Vert (80 bleues + 80 ul ul marron),
Mauve (80 ul bleues + 80 rouges ul).
Une couleur sixième, Orange (80 ul rouges + 80 ul brun), peut également être utilisé mais il est souvent difficile à distinguer de brun.