Dissection de l'organisateur et explants pôle animal à partir d'embryons de Xenopus laevis et de l'Assemblée d'un test d'adhésion cellulaire

Résumé

Cette vidéo montre la technique utilisée pour la préparation de l'organisateur et les explants pôle animal à partir d'embryons de Xenopus laevis, y compris l'utilisation du couteau sourcils - un outil de dissection spécialisée est fait de son sourcil. Le protocole pour l'assemblage d'un test d'adhérence est également donnée, ce qui sondes pour détecter la présence de molécules d'adhérence clés présents sur la surface de l'organisateur ou de cellules pôle animal qui sont critiques pour le bon développement.

Protocole

Préparation Chambres d'adhésion (le jour avant l'injection / dissection)

Chambres Assay adhésion

Si vous avez un microscope composé classique (localise optiques dessus de la scène), il est ncecessary de faire un peu de hauteur de chambre d'adhérence comme suit. Si vous utilisez le microscope inversé-optique, puis "NUNC Lab-Tek lamelle couvre-objet Chambered" peut seulement être utilisée, et de sauter les étapes # 1 - 2.

1. Fixez l'un des «press-to-joint isolant silicone" sur un feuillet de 40 x 24mm couvercle. Pressez fermement l'isolant de la lamelle sur la paillasse propre et regarder de l'autre côté pour s'assurer que l'isolant est totalement attachée sans bulles d'air.
   
   
2. Optionnel: Mettez les chambres d'adhérence dans un plat en verre de Pétri avec papier filtre Whatman et autoclaver à sec sur le cycle de stérilisation. Les refroidir à température ambiante.

Revêtement de la Chambre

1. Mettez une goutte de 200ml Solution de travail de la cadhérine (10mg/ml) ou de la fibronectine (20mg/ml) au centre d'une chambre d'adhérence autoclave, en utilisant sigmacoated pointes jaunes. Incuber à température ambiante pendant 4 heures.
   
   
2. Sortez la solution cadhérine ou la fibronectine et transférer dans un tube de 1.5ml. Cette solution peut être réutilisée pour les deux prochaines semaines.
   
   
3. Distribuer 500ml de BSA 4% en 1x MBS-H pour bloquer la chambre. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
   
   
4. Aspirer la solution de BSA. Laver la chambre avec 500ml de 1x MBS-H à deux reprises. Après le second lavage, aspirer la plupart des MBS-H (pas complètement), et stocker dans un conteneur scellé à 4 º C. Cette chambre d'adhérence est bonne pour les 2 prochains - 3 jours.

Dissection et dissociation des explants Cap animaux

1. Incuber les embryons injectés dans 0,1 x MBS-H, dilués à partir du 1x autoclavé MBS-H, comme non autoclavé moyennes effectue parfois des germes peu qui peuvent perturber les cellules dissociées bouchon d'origine animale.
   
   
2. Faire 1x Barth agarose plaques et CMF-MBS plaques d'agarose avec des plats de 60mm, au moins autant que le nombre de vos échantillons. Verser autoclavé 1x MBS-H pour les plaques 1x Barth. Pour CMF-MBS assiettes, versez 10 ml de FMC-MBS.
   
   
3. Lorsque les embryons deviennent étape 8.5, commencez disséquer les calottes animales dans l'assiette une Barth 1x est. 10 à 15 explants par les échantillons sont généralement suffisant pour une expérience.
   
   
4. Transférer les explants calotte animale à une plaque de FMC-MBS. Incuber les explants pour 45 - 60 minutes jusqu'à ce que les explants sont complètement dissociés. Agitations doux dans toutes les 15 minutes vous aidera à la dissociation.

Essai d'adhésion cellulaire

1. Ensemencement des cellules: Distribuer 500ml de 1x MBS-H pour la chambre de l'adhérence préparés dans les étapes dans les sections ci-dessus, les Chambres de dosage adhérence et de revêtement de la Chambre. Transférer les cellules dissociées calotte animale de la plaque de FMC-MBS à la chambre de l'adhérence à l'aide d'un P200 conseils sigmacoated et hachées-off jaune.
   
   
2. Facultatif: Si possible, soigneusement aspirer la moyenne jusqu'à environ 2 / 3 à mi-chemin, sans exposer les cellules à l'air. Ajouter environ la même quantité de produits frais MBS-H, pour s'assurer que le milieu contient suffisamment de Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +.}
   
   
3. Incuber à température ambiante pendant 45 à 90 minutes. Vérifiez les cellules à l'occasion de voir si elles sont attachés à la surface du fond.
   
   
4. Maintenant, vous pouvez prendre la photo des cellules sous un microscope.
   
   
5. Mettez la chambre de l'adhérence sur une lame de verre de la grille. Aligner l'un des coins de la chambre de l'adhésion à un coin de la diapositive de la grille. Compter et noter le nombre de cellules attachées dans plusieurs grilles différentes.
   
   
6. Verser 1 litre de MBS-H dans un grand seau en plastique (par exemple, Tupperware, etc.) Sans forcer, insérez la chambre glisser l'adhérence au fond du seau. Faites-la tourner sur le agitateur orbital pendant cinq minutes à basse vitesse (50 - 60rpm).
   
   
7. Mettez la chambre de l'adhérence de retour sur la diapositive de grille, en alignant le même coin de la chambre pour le même coin de la diapositive grille, comme l'a fait à l'étape n ° 5 du présent article, Assay adhésion cellulaire. Comptez le nombre de cellules qui restent attachés sur la même grille que vous avez compté avant le lavage. Calculer le pourcentage de cellules qui restent attachées après le lavage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x MBS-H	Tampon			Milieu de Barth’s modifié : recette pour 1 L : 5,14 g NaCl 75 mg KCl 0,2 g NaHCO3 0,2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, acide libre. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser à l'autoclave.
CMF-MBS	Tampon			Il s'agit de la version sans Ca2+/Mg2+ du MBS-H. Recette pour 500 mL : 2,57 g NaCl 37,5 mg KCl 0,1 g NaHCO3/sub> 1,19 g HEPES, acide libre. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser à l'autoclave.
Plaques d'agarose à 1 % / 1x Barth’s				autant que le nombre d'échantillons
Plaques d'agarose à 1 % / CMF-MBS				autant que le nombre d'échantillons
E-Cadhérine/Fc chimérique	Réactif	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissoudre 0,1 mg d'E-cadhérine solide dans 100 µL de MBS-H 1x contenant 40 % de glycérol pour obtenir une solution mère 100x (1,0 mg/mL). Conserver à –20 °C. Diluer 1/100 avec du MBS-H 1x pour obtenir une solution de travail à 10 µg/mL juste avant utilisation. Vous avez besoin de 200 µL par échantillon de cette solution de travail.
Fibronectine, solution à 0,1 %	Réactif	Sigma-Aldrich	F-1141	Cette solution prête à l'emploi peut être utilisée comme stock 50x. Diluer 1/50 avec du MBS-H 1x pour obtenir une solution de travail à 20 μg/mL juste avant utilisation. Vous avez besoin de 200 μL par échantillon de cette solution de travail. Je ne recommande pas d'utiliser de la fibronectine sous forme solide, car il est difficile de la dissoudre à une concentration de 0,1 % pour préparer la solution mère. Bien qu'elle soit plus coûteuse, cette solution prête à l'emploi à 0,1 % permet d'obtenir des résultats plus reproductibles.
BSA à 4 % / MBS-H	Tampon			BSA : fraction V de grade biologie moléculaire
Pipettes jaunes Sigmacoted	Outil
Lames de couverture No.1				40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm
Isolateur en silicone pressé (Press-to-seal)	Outil	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	profondeur de 2,5 mm x diamètre de 20 mm
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Outil	Fisher Scientific	12-565-471	2 puits/lame
Verre à grille (graticule)	Outil			ou graticule Finder pour le comptage cellulaire