Dissection de l'organisateur et explants pôle animal à partir d'embryons de Xenopus laevis et de l'Assemblée d'un test d'adhésion cellulaire

Résumé

Cette vidéo montre la technique utilisée pour la préparation de l'organisateur et les explants pôle animal à partir d'embryons de Xenopus laevis, y compris l'utilisation du couteau sourcils - un outil de dissection spécialisée est fait de son sourcil. Le protocole pour l'assemblage d'un test d'adhérence est également donnée, ce qui sondes pour détecter la présence de molécules d'adhérence clés présents sur la surface de l'organisateur ou de cellules pôle animal qui sont critiques pour le bon développement.

Protocole

Préparation Chambres d'adhésion (le jour avant l'injection / dissection)

Chambres Assay adhésion

Si vous avez un microscope composé classique (localise optiques dessus de la scène), il est ncecessary de faire un peu de hauteur de chambre d'adhérence comme suit. Si vous utilisez le microscope inversé-optique, puis "NUNC Lab-Tek lamelle couvre-objet Chambered" peut seulement être utilisée, et de sauter les étapes # 1 - 2.

1. Fixez l'un des «press-to-joint isolant silicone" sur un feuillet de 40 x 24mm couvercle. Pressez fermement l'isolant de la lamelle sur la paillasse propre et regarde....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x MBS-H	Tampon			Milieu de Barth’s modifié : recette pour 1 L : 5,14 g NaCl 75 mg KCl 0,2 g NaHCO3 0,2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, acide libre. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser à l'autoclave.
CMF-MBS	Tampon			Il s'agit de la version sans Ca2+/Mg2+ du MBS-H. Recette pour 500 mL : 2,57 g NaCl 37,5 mg KCl 0,1 g NaHCO3/sub> 1,19 g HEPES, acide libre. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser à l'autoclave.
Plaques d'agarose à 1 % / 1x Barth’s				autant que le nombre d'échantillons
Plaques d'agarose à 1 % / CMF-MBS				autant que le nombre d'échantillons
E-Cadhérine/Fc chimérique	Réactif	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissoudre 0,1 mg d'E-cadhérine solide dans 100 µL de MBS-H 1x contenant 40 % de glycérol pour obtenir une solution mère 100x (1,0 mg/mL). Conserver à –20 °C. Diluer 1/100 avec du MBS-H 1x pour obtenir une solution de travail à 10 µg/mL juste avant utilisation. Vous avez besoin de 200 µL par échantillon de cette solution de travail.
Fibronectine, solution à 0,1 %	Réactif	Sigma-Aldrich	F-1141	Cette solution prête à l'emploi peut être utilisée comme stock 50x. Diluer 1/50 avec du MBS-H 1x pour obtenir une solution de travail à 20 μg/mL juste avant utilisation. Vous avez besoin de 200 μL par échantillon de cette solution de travail. Je ne recommande pas d'utiliser de la fibronectine sous forme solide, car il est difficile de la dissoudre à une concentration de 0,1 % pour préparer la solution mère. Bien qu'elle soit plus coûteuse, cette solution prête à l'emploi à 0,1 % permet d'obtenir des résultats plus reproductibles.
BSA à 4 % / MBS-H	Tampon			BSA : fraction V de grade biologie moléculaire
Pipettes jaunes Sigmacoted	Outil
Lames de couverture No.1				40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm
Isolateur en silicone pressé (Press-to-seal)	Outil	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	profondeur de 2,5 mm x diamètre de 20 mm
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Outil	Fisher Scientific	12-565-471	2 puits/lame
Verre à grille (graticule)	Outil			ou graticule Finder pour le comptage cellulaire