Navettes moléculaires constitués de microtubules fonctionnalisés glissant sur la surface collée protéines motrices kinésine peut servir de système de transport nanométrique. Ici, le montage d'un système de navette typique est décrit.
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Article de méthode
Chargement du fret sur la kinésine Powered navettes moléculaires
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules ont évolué sophistiqué machinerie moléculaire, tels que les protéines motrices kinésine microtubules et de filaments, pour soutenir le transport intracellulaire actif de la cargaison. Alors que kinésines queue domaine se lie à une variété de cargaisons, domaines kinésines tête d'utiliser l'énergie chimique stockée dans les molécules d'ATP à l'étape le long du réseau de microtubules. Les longs microtubules raides servir de pistes pour le transport longue distance intracellulaire.
Ces moteurs et des filaments peut également être utilisé dans des environnements synthétiques microfabriqués en tant que composants de navettes moléculaires 1. Dans un motif fréquemment utilisés, les moteurs kinésine sont ancrées à la surface de la piste par le biais de leur queue, et microtubules fonctionnalisés servir éléments de transport de marchandise, qui sont propulsés par ces moteurs. Ces navettes peuvent être chargés de marchandises en utilisant la liaison forte et sélective entre la biotine et la streptavidine. Les composants clés (tubuline biotinylé, streptavidine et biotinylated fret) sont disponibles dans le commerce.
En s'appuyant sur le test de motilité inversé classique 2, la construction de navettes moléculaires est détaillée ici. Kinésine protéines motrices sont adsorbés sur une surface préalablement enduite avec de la caséine; microtubules sont polymérisés à partir de tubuline biotinylé, adhéré à la kinésine et ensuite revêtus avec de la rhodamine-streptavidine marquée. La concentration d'ATP est maintenue à une concentration subsaturating pour obtenir une vitesse de glissement des microtubules optimale pour le chargement 3. Enfin, biotinylé marqué à la fluorescéine nanosphères sont ajoutés en tant que cargaison. Nanosphères joindre aux microtubules du fait de collisions entre des microtubules de glisse et des nanosphères adhérant à la surface.
Le protocole peut être facilement modifié pour charger une variété de marchandises telles que l'ADN biotinylé 4, 5 ou points quantiques d'une grande variété d'antigènes au moyen d'anticorps biotinylés 4-6.
Protocole
1.) Tampons et réactifs
Ces solutions doivent être préparées à l'avance et stocké en aliquotes de taille pratique. Une aliquote doit contenir suffisamment de solution pour une expérience typique et une autre partie aliquote doit être utilisé pour chaque test de motilité. Les conditions de stockage et de tailles typiques aliquotes sont également mentionnées dans les protocoles suivants.
1. BRB80 tampon (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA dans désionisée distillée (dd) d'eau, le pH ajusté à 6,9 par KOH)
- Préparez une solution de 100 ml de bouillon de 0,5 M EGTA dans l'eau dd. Ajuster le pH à 7,....
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Discussion
Avec des modifications mineures, ce protocole a été utilisé avec succès par une variété de groupes d'assembler kinésine-microtubules tests de motilité base. 10 mM de DTT dans la solution finale motilité peut être remplacé par 0,5% β-mercaptoéthanol. Solutions standard (BRB80AF, KIN20 et MT1000) plus de 2 heures ne doit pas utilisé. Toute solution contenant du taxol microtubules et surtout ne doit jamais être placé sur la glace. Une exposition excessive de la cellule d'écoulement aux UV des résultats de lumière d.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous sommes très reconnaissants à Jonathan Howard, dont le groupe a développé le protocole de base pour un test de mobilité par glissement qui a ensuite été adapté par nos soins. Le soutien financier de la NSF subvention DMR0645023 est grandement appréciée.
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Matériaux
| Nom du produit | Type | Entreprise | Numéro de catalogue | Commenter |
|---|---|---|---|---|
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
| Adénosine-5'-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Tubuline biotine | Cytosquelette Inc | T333 | ||
| Caséine | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotréitol (TNT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| L'acide N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) - éthylène glycol-bis (2-aminoéthyléther) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres biotinylé microsphères, 40 nm, jaune-vert fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| La glucose oxydase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5'-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Du chlorure de magnésium (MgCl 2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Le paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acide pipérazine-1 ,4-bis (2-éthanesulfonique), Ppipérazine-N, N'-bis (2-éthanesulfonique) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| L'hydroxyde de potassium (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| L'hydroxyde de sodium (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidine conjugué Alexa Fluor 568 | Invitrogen | S11226 |
Références
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.<....
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Réimpressions et autorisations
