Ce protocole est un extrait de Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp.(2019).
Toutes les expériences de cette étude ont été menées conformément au Guide des National Institutes of Health des États-Unis pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les protocoles sur les animaux de cette étude ont été approuvés par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’UCLA.
1. Induction de l’anesthésie
- Préparez l’anesthésie par immersion pour le contrôle de la douleur et l’immobilisation des poissons afin d’éviter les artefacts de mouvement lors de l’acquisition des données ECG. La plupart des laboratoires utilisent de la tricaïne par immersion (méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle, MS-222).
- Pour préparer la solution mère de tricaïne à 0,4 %, combinez les éléments suivants dans une bouteille en verre foncé à bouchon vissé : 400 mg de poudre de tricaïne, 98 ml d’eau distillée double et 2 ml de 1 M de Tris (pH 9). Ajustez à pH 7,0 en utilisant 1 N NaOH ou 1 N HCl au besoin.
- Pour préparer la solution finale d’immersion de tricaïne, déterminez la concentration minimale appropriée pour l’âge, la taille, l’état métabolique, la souche, le modèle de maladie, les objectifs scientifiques et la durée de la procédure du poisson-zèbre.
- Effectuer une étude concentration-réponse à la tricaïne, en augmentant ou en diminuant la concentration recommandée de 168 mg/L (ou 0,0168 %)9si nécessaire, pour atteindre le niveau 4 d’anesthésie en 3 minutes avec le moins de toxicités cardiorespiratoires possible. Par exemple, dans cette étude, l’immersion de poissons-zèbres AB de type sauvage âgés de 12 à 18 mois dans une solution de tricaïne à 0,02-0,04 % induira le niveau 4 d’anesthésie en 3 min
REMARQUE : Au niveau 4 de l’anesthésie, l’équilibre et le tonus musculaire sont complètement perdus et le taux de mouvement operculaire est réduit.
- Au besoin, consultez le vétérinaire du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) pour obtenir des conseils supplémentaires sur la pertinence du choix de l’anesthésique et de la voie d’administration.
- Immergez un poisson-zèbre adulte dans une boîte contenant une solution de tricaïne de la plus faible concentration prédéterminée et approuvée par l’IACUC (par exemple, 0,02-0,04 % dans cette étude) pour induire le niveau 4 d’anesthésie en 3 minutes (Figure 1).
- Pour le protocole ECG de survie, gardez la séance d’enregistrement ECG aussi brève que possible (moins de 10 min). Pour de brèves séances d’enregistrement ECG d’une durée inférieure à 15 min, l’entretien de l’anesthésie n’est pas nécessaire.
- Pour de longues séances d’enregistrement ECG qui durent des heures, utilisez un système de perfusion intramusculaire à action prolongée et un système de perfusion orale pour fournir une hydratation et une oxygénation suffisantes.
2. Placement de la sonde ECG
- Une fois que le poisson-zèbre maintient le niveau 4 d’anesthésie pendant 3 secondes, utilisez une paire de pinces émoussées pour transférer immédiatement le poisson sur la fente de l’éponge humide avec sa surface ventrale vers le haut pour la mise en place des électrodes de sonde ECG (Figure 2).
- Insérez doucement les trois électrodes électrodes ECG dans la musculature du poisson jusqu’à environ 1 mm de profondeur pour établir une sonde bipolaire dans le plan frontal parallèle à l’orientation crânienne gauche-droite de l’axe principal cardiaque.
- Positionnez l’électrode positive (rouge) sur la ligne médiane ventrale au niveau du bulbe artériel, c’est-à-dire à 1-2 mm au-dessus d’une ligne imaginaire reliant les deux bords inférieurs des opercules (Figure 2A).
- Positionnez l’électrode négative (noire) dans le sens de la caudale et de 0,5 à 1,0 mm vers la gauche de l’électrode positive, à une distance supérieure à la longueur apicobasale maximale du ventricule du poisson-zèbre adulte (figure 2A).
- Positionnez l’électrode de référence (verte) de manière caudale, près de la région anale.
REMARQUE : Étant donné que l’axe principal cardiaque varie quelque peu d’un poisson à l’autre, pour maximiser les amplitudes des ondes R et T, ajustez les positions des dérivations en n’apportant que de petits changements systématiques par essais et erreurs. Par exemple, changez une électrode (positive ou négative), au lieu des deux électrodes, à la fois et effectuez des changements progressifs dans une direction spécifiée avant de passer à une autre direction au lieu d’effectuer des changements erratiques dans des directions aléatoires.
3. Enregistrement ECG
- Ouvrez le programme d’acquisition de données ECG. Sélectionnez le paramètre souhaité dans les menus déroulants pour la portée, le passe-bas et le passe-haut. Par exemple, le réglage suivant dans le système d’enregistrement ECG in vivo utilisé dans cette expérience donne un rapport signal/bruit cohérent et satisfaisant pour un poisson-zèbre adulte normal : plage « 2 mV », passe-bas « 120 Hz » et passe-haut « 0,03 s ».
- Appuyez sur Start pour démarrer l’enregistrement ECG continu sans espace à une fréquence d’échantillonnage de 1 kHz.
- Pour optimiser le positionnement de la sonde afin d’obtenir un rapport signal/bruit maximal, appuyez sur Stop pour arrêter l’enregistrement ECG et examinez le tracé ECG peu de temps après la toute première tentative d’enregistrement pour chaque cœur. Pour diagnostiquer qu’un ECG de poisson-zèbre adulte est normal, confirmez que les quatre critères de validation suivants sont satisfaits (Figure 3) :
- Critère 1 : Assurez-vous que toutes les formes d’onde de l’ECG (P, QRS et T) sont distinctes et facilement visibles.
- Critère 2 : Assurez-vous que l’onde P est positive.
- Critère 3 : S’assurer que le complexe QRS net est positif (c’est-à-dire que l’amplitude de l’onde R est supérieure à la somme des amplitudes des ondes Q et S).
- Critère 4 : S’assurer que l’onde T est positive.
- Si un ECG normal est attendu, repositionnez les électrodes (essayez d’abord l’électrode négative) si nécessaire, jusqu’à ce que les quatre critères de validation soient satisfaits.
- Si une onde T normale est attendue, mais que l’onde T est trop petite, repositionnez les électrodes pour maximiser l’amplitude de l’onde T.
- Reprendre l’enregistrement ECG après avoir optimisé le positionnement de la sonde. Enregistrez les balayages ECG pour une analyse ultérieure.
4. Récupération après l’anesthésie
- À la fin de la séance d’enregistrement ECG, retirez soigneusement les électrodes sans blesser le poisson. Transférez le poisson dans de l’eau de poisson fraîche et oxygénée sans tricaïne.
- Pour faciliter la récupération après l’anesthésie, versez vigoureusement de l’eau sur les branchies avec une pipette Pasteur jusqu’à ce que le poisson reprenne le mouvement régulier des branchies ou nage.
- Surveillez le poisson pour s’assurer qu’il se remet complètement de l’anesthésie (généralement 1 à 2 minutes), comme l’indique la capacité du poisson à nager debout pendant au moins 5 s.
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