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Abstract

Source : Muto, A., et al. Ablation d’une population neuronale à l’aide d’un laser à deux photons et son évaluation à l’aide de l’imagerie calcique et de l’enregistrement comportemental chez les larves de poisson-zèbre. J. Vis. Exp.(2018)

Cette vidéo décrit le test de capture de proies. La vidéo traite de la méthode d’étude du comportement de capture de proies des larves de poisson-zèbre après l’ablation au laser de neurones spécifiques.

Protocol

1. Évaluation des conséquences comportementales suite à l’ablation au laser

1. Mettre en place un système d’enregistrement comportemental composé d’un stéréoscope équipé d’une caméra vidéo. Utilisez un appareil photo doté d’un logiciel d’acquisition d’images approprié, commercial ou personnalisé (Figure 1A).
2. Optimiser les conditions d’éclairage afin que la paramécie puisse être détectée par le traitement de l’image. Par exemple, utilisez une lampe LED blanche annulaire avec une entretoise (Figure 1B).
   Remarque : La distance et l’angle de la LED affectent l’apparence de l’échantillon (c’est-à-dire clair sur fond sombre ou sombre sur fond clair) et sont donc essentiels pour un traitement d’image réussi. Déterminez la meilleure hauteur de l’entretoise (Figure 1C).
3. Placez une larve de poisson-zèbre (récupérée lors de l’expérience d’ablation laser décrite à la section 1) dans une chambre d’enregistrement comportemental (qui a été fixée à une lame de verre) avec le sceau supérieur d’origine retiré (Figure 1D).
4. Prélever 50 paramécies en suspension dans l’eau du bécher à l’aide d’une micropipette et les placer dans la chambre d’enregistrement.
5. Placez une lamelle sur le dessus de la chambre d’enregistrement. Mettez une petite goutte d’eau sur la lamelle avant de la placer sur la surface de l’eau de la chambre d’enregistrement pour éviter d’introduire de l’air dans la chambre.
   Remarque : Dans cette étape, une partie de l’eau contenant des paramécies débordera de la chambre d’enregistrement. Le nombre restant de paramécies dans la chambre d’enregistrement sera d’environ 30 à 40.
6. Placez la chambre d’enregistrement (contenant une larve et une paramécie) dans le système d’éclairage (figure 1D).
7. Démarrez l’enregistrement en accéléré à 10 ips pendant 11 min (6 600 images).
8. (Facultatif) Pour chaque larve dont le comportement a été testé, observez la fluorescence des zones ablées au laser par microscopie fluorescente pour confirmer l’efficacité de l’ablation au laser (c’est-à-dire l’absence ou le nombre considérablement réduit de cellules fluorescentes dans la zone irradiée au laser).
   Remarque : Même après l’irradiation, certaines cellules fluorescentes peuvent encore être observées en raison de l’apparition plus tardive de l’expression du gène Gal4 dans les cellules qui se sont différenciées après l’ablation.
9. Après avoir enregistré le comportement de la larve, pour compenser le manque d’uniformité en arrière-plan, effectuez une division pixel par pixel de chaque image par une image moyenne aux Fidji : cliquez sur ‘Traiter’, ‘Calculatrice d’image’, ‘Opération : Diviser’, ’32-bit(float)result’ et ‘OK’. Pour créer une image moyenne, cliquez sur « Image », « Piles », « Projet Z », « Intensité moyenne » et « OK » (Figure 1E, F).
10. Comptez le nombre de paramécies restantes dans la chambre en cliquant sur ‘Analyser’, ‘Analyser les particules’, en définissant une plage de zones qui couvre toutes les paramécies, en cochant la case ‘Afficher :Masques’ et en cliquant sur ‘OK’. L’option ‘Show :Masks’ fournira une image de paramécie extraite (Figure 1G), avec une liste du nombre de particules (paramécies) dans chaque image.
11. Tracez le nombre de paramécies restantes dans la chambre d’enregistrement au fil du temps. Étant donné que les estimations du nombre de paramécies sont bruitées, nous recommandons d’effectuer une moyenne mobile sur chaque point dans une plage de 600 images (1 min) sur la feuille de calcul.

Representative Results

Materials

Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0 	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU 	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS  	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging