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1. Transfert de bibliothèque de petites molécules
Bien que le transfert composé puisse être automatisé avec des méthodes de transfert robotisées, nous décrirons la méthode de transfert manuel.
Les - banques de petites molécules sont généralement fournies dans un format à 96 puits, chaque composé étant stocké dans du DMSO sous la forme d’un stock de 10 mM. Environ 60 minutes avant que les embryons n’atteignent le stade où les composés doivent être ajoutés, décongelez le nombre souhaité de plaques à 96 puits contenant des aliquotes de petites molécules (plaque source). Prenez note du numéro de série ou d’un autre numéro d’identification des plaques sources. Pour minimiser la condensation sur les plaques, la décongélation peut se produire dans une chambre de dessiccation contenant de la drierite (W.A. HAMMOND DDRYERITE CO, Xenia, OH).
- Faites tourner brièvement les plaques dans une centrifugeuse de table équipée d’un adaptateur de plaque multi-puits.
- Retirez le ruban d’étanchéité en aluminium de la plaque source. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, diluer les composés dans la plaque source à la concentration de 0,5 mM (par exemple, si vous commencez avec des aliquotes de 250 nL de 10 mM, ajouter 4,75 μL de DMSO dans chaque puits).
- Lorsque les embryons de la plaque à 96 puits (plaque receveuse) atteignent le stade souhaité, utilisez une pipette à 12 canaux (2-20 μL) pour transférer 2,5 μL de composés (0,5 mM) des plaques sources dans les plaques réceptrices contenant les embryons.
- Inscrivez le numéro d’identification des plaques sources sur les plaques d’embryons receveurs. Couvrez les plaques receveuses contenant maintenant les embryons et les composés avec des couvercles, mélangez doucement les plaques en les agitant doucement et placez-les dans un incubateur à 28,5 °C.
- Recouvrez chaque plaque source contenant de petites molécules inutilisées (0,5 mM) d’un ruban d’étanchéité en aluminium et placez-la dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme.
2. Dépistage des effets des petites molécules par inspection visuelle des phénotypes
- Avant d’effectuer le dépistage, formulez un critère précis pour déterminer ce qui constituerait un « succès ».
- Aux moments souhaités du développement, retirer de l’incubateur les plaques à 96 puits contenant des embryons traités et examiner chaque puits au stéréomicroscope. Pour une meilleure visualisation des changements subtils, tels que les changements dans le schéma circulatoire, un microscope inversé à contraste de phase peut être utilisé. La microscopie à fluorescence peut être utilisée pour examiner la perturbation de l’expression des protéines GFP ou DsRed sous un promoteur spécifique au tissu.
- Scannez rapidement les plaques de 96 puits pour trouver un puits dans lequel au moins 3 embryons sur 5 présentent le phénotype « hit » prescrit. Notez l’identité de la plaque et l’emplacement du puits de chaque coup potentiel.
- Reconfirmez un coup potentiel en testant à nouveau les effets du composé à plusieurs doses (1 uM, 5 uM, 10 μM et 50 μM). Pour chaque dose, 10 embryons sont analysés dans 0,5 mL de milieu E3 dans un format de plaque de 48 puits. Le moment de l’ajout du composé pour le nouvel essai doit être identique à celui du dépistage initial. Un résultat positif est confirmé lorsque le phénotype provoqué est reproduit lors d’un nouveau test du composé
- Identifiez le composé à succès à partir de la base de données des petites molécules de la bibliothèque chimique.