1. Préparation des embryons/larves
- Transférez 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 25 ml d’eau d’œuf. Ne conservez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri et élevez-les à 28 °C.
- Pour inhiber la pigmentation, ajoutez de la phénylthiourée (PTU) dans les boîtes de Pétri avant 10 heures après la fécondation (hpf), et élevez les embryons/larves jusqu’à 80 hpf. La concentration finale de PTU est de 0,2 mM.
ATTENTION : Le PTU est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
- Anesthésier les larves en ajoutant de l’ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (tricaïne), à une concentration finale de 0,016 %, dans les boîtes de Pétri. Ensuite, à l’aide d’un microscope à épifluorescence, trier les larves positives à la CFP. Utilisez des larves ayant une taille de foie similaire et jetez celles dont le foie est plus petit ou plus grand.
REMARQUE : toutes les larves positives à la CFP, quelle que soit leur intensité, peuvent être utilisées car il n’y a pas de différence dans l’étendue de l’ablation des hépatocytes entre les larves hémizygotes et homozygotes.
ATTENTION : la tricaïne est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
- Retirez l’eau d’œuf contenant de la tricaïne et ajoutez de l’eau d’œuf complétée par 0,2 mM de PTU. Maintenir les embryons/larves à 28 °C.
2. Traitement Mtz
- Préparez une solution fraîche de 10 mM de Mtz en dissolvant 0,171 g de poudre de Mtz dans 100 ml d’eau d’œuf complétée par 0,2 % de DMSO et 0,2 mM de PTU. Pour dissoudre complètement le Mtz, mélangez la solution à RT en remuant rapidement pendant 20 à 30 minutes. Pour aider à solubiliser Mtz et à améliorer la perméation de Mtz dans les larves, ajoutez du DMSO lors de la préparation de Mtz.
ATTENTION : une exposition prolongée ou une concentration accrue de Mtz est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
- Séparez les larves en groupes témoins et en groupes expérimentaux en transférant le nombre désiré de larves dans deux boîtes de Pétri différentes de 100 mm ou une plaque multi-puits. Pour le groupe expérimental, conserver les larves dans une solution de 10 mM Mtz ; pour le groupe témoin, conservez-les dans de l’eau d’œuf contenant 0,2 % de DMSO.
- Couvrir les plaques ou les boîtes de Pétri contenant la solution de Mtz avec du papier d’aluminium pour éviter la photo-inactivation de Mtz, et incuber à 28 °C. La durée du traitement par Mtz dépend du stade larvaire et de la lignée transgénique.
3. Analyse de la régénération hépatique induite par les voies biliaires
- À la fin de la période d’ablation, retirer la solution de Mtz des plaques. Lavez les larves traitées au Mtz en ajoutant 25 ml d’eau d’œuf. Retournez l’assiette 2 à 3 fois pour laver les larves avant de jeter l’eau de l’œuf. Répétez l’opération trois fois, puis plongez à nouveau les larves dans l’eau de l’œuf. Pour éviter l’œdème cardiaque et la mort larvaire chez les larves traitées au Mtz, ajoutez une concentration plus faible de tricaïne, à une concentration finale de 0,008 %, pour immobiliser les larves.
- Pour l’analyse du foie, examinez la taille du foie des larves traitées au Mtz au microscope à épifluorescence avec le filtre CFP. Évaluez les niveaux d’ablation des hépatocytes en fonction de la taille relative du foie : grand (non ablaté ; 0 à 10 % de larves), moyen (partiellement enlevé ; 10 à 20 %) et très petit (entièrement ablaté ; 80 à 90 %).
