Injection de morpholino : une méthode pour inhiber l’expression génique cible afin d’étudier la fonction chez le poisson zèbre

Résumé

Source : Hyde D.R., et al. Électroporation in vivo de Morpholinos dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération. J. Vis. Exp. (2012)

Le protocole décrit l’inhibition ciblée de l’expression génique chez le poisson zèbre par injection de morpholino dans la queue.

Protocole

1. Injection de Morpholino

1. La veille de l’injection du morpholino, faites une plaque d’injection (Figure 1). Assurez-vous de découper une encoche à une extrémité du puits, ce qui aide à stabiliser le poisson pour la procédure de microinjection.
2. Diluez le morpholino marqué à la fluorescéine à la concentration appropriée (il est recommandé de commencer par 1,2 mM) et placez-le dans un bain-marie à 65 °C, pendant 5 minutes.
3. Chargez l’aiguille avec le morpholino (remarque : selon que vous remplissez ou chargez votre aiguille en arrière, vous déterminerez si vous chargez l’aiguille en premie....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino doit être conçu sur mesure en fonction de la protéine qui vous intéresse
Pompe de micro-injection	World Precision Instruments, Inc.	PV830	PicoPump pneumatique De nombreux systèmes de micro-injection différents peuvent être utilisés
Micro-manipulateur	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Droitier (MMJL pour gaucher)
Aiguilles de micro-injection, diamètre extérieur 1,0 mm	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	Il s’agit de capillaires en verre borosilicaté, tirés dans une aiguille
Porte-aiguille	World Precision Instruments, Inc.	5430-TOUS	Kit de buses Pico ; assurez-vous d’insérer le joint de pipette de 1,0 mm
Extracteur d’aiguille	Sutter Instrument Co.	P-97	D’autres extracteurs de micropipettes/aiguilles devraient également fonctionner
microscope	Leica, Nikon, Zeiss	Le nombre varie selon le fabricant	Tout stéréomicroscope avec une optique 20X et la possibilité de travailler avec des micromanipulateurs
2-Phénoxyéthanol	Sigma-Aldrich	Référence 77861-1L	Anesthésie : diluer 1:1000 dans l’eau du système de poisson pour l’intervention, 1:500 pour l’euthanasie