Injection de morpholino : une méthode pour inhiber l’expression génique cible afin d’étudier la fonction chez le poisson zèbre

Résumé

Source : Hyde D.R., et al. Électroporation in vivo de Morpholinos dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération. J. Vis. Exp. (2012)

Le protocole décrit l’inhibition ciblée de l’expression génique chez le poisson zèbre par injection de morpholino dans la queue.

Protocole

1. Injection de Morpholino

1. La veille de l’injection du morpholino, faites une plaque d’injection (Figure 1). Assurez-vous de découper une encoche à une extrémité du puits, ce qui aide à stabiliser le poisson pour la procédure de microinjection.
2. Diluez le morpholino marqué à la fluorescéine à la concentration appropriée (il est recommandé de commencer par 1,2 mM) et placez-le dans un bain-marie à 65 °C, pendant 5 minutes.
3. Chargez l’aiguille avec le morpholino (remarque : selon que vous remplissez ou chargez votre aiguille en arrière, vous déterminerez si vous chargez l’aiguille en premier ou si vous coupez la pointe en premier).
4. Coupez la pointe de l’aiguille en biais.
5. Suivez les instructions de votre système de micro-injection pour injecter une bulle d’environ 5 nl de morpholino par injection. Des volumes plus importants de morpholino pourraient perturber les tissus.
6. Anesthésez le poisson et placez-le sur une plaque d’injection. Retirez tout excès de liquide et orientez l’aiguille à l’endroit approprié, juste distal par rapport au rayon osseux (Figure 2). À l’aide d’un microscope et d’un appareil de micro-injection adapté aux injections de morpholino (voir Tableau des réactifs spécifiques), injectez le morpholino dans la nageoire de l’avant vers l’arrière, comme le montre la figure 2. L’injection de l’arrière vers l’antérieur provoque l’enroulement du tissu de la nageoire pendant l’injection et est très difficile.
7. Insérez doucement l’aiguille dans le tissu régénérateur, juste distal à chaque rayon osseux (marqué « 1 » sur la figure 2) et poussez distalement jusqu’à ce qu’il soit situé dans le blastème (marqué « 2 » sur la figure 2). Veillez à ne pas enfoncer l’aiguille dans toute la nageoire. Lorsque l’aiguille est correctement localisée, injectez le morpholino (c’est-à-dire cliquez une fois). À 1,2 mM, la solution de morpholino marquée à la fluorescéine apparaît jaune-vert, même dans des conditions de lumière normales. À chaque injection, une « bouffée » jaune de solution morpholino peut être visualisée, ce qui aide à localiser l’injection dans le blastème. Environ 75 nl (10-15 clics) de solution morpholino doivent être injectés par rayon osseux. Pause de ~ 1 seconde entre les clics. Nous injectons uniquement la face dorsale, en utilisant la ventrale comme contrôle par électroporation uniquement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino doit être conçu sur mesure en fonction de la protéine qui vous intéresse
Pompe de micro-injection	World Precision Instruments, Inc.	PV830	PicoPump pneumatique De nombreux systèmes de micro-injection différents peuvent être utilisés
Micro-manipulateur	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Droitier (MMJL pour gaucher)
Aiguilles de micro-injection, diamètre extérieur 1,0 mm	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	Il s’agit de capillaires en verre borosilicaté, tirés dans une aiguille
Porte-aiguille	World Precision Instruments, Inc.	5430-TOUS	Kit de buses Pico ; assurez-vous d’insérer le joint de pipette de 1,0 mm
Extracteur d’aiguille	Sutter Instrument Co.	P-97	D’autres extracteurs de micropipettes/aiguilles devraient également fonctionner
microscope	Leica, Nikon, Zeiss	Le nombre varie selon le fabricant	Tout stéréomicroscope avec une optique 20X et la possibilité de travailler avec des micromanipulateurs
2-Phénoxyéthanol	Sigma-Aldrich	Référence 77861-1L	Anesthésie : diluer 1:1000 dans l’eau du système de poisson pour l’intervention, 1:500 pour l’euthanasie