L’accouplement et la mise en scène des ovules : une méthode pour générer des embryons et les trier par stade de développement

Résumé

Source : Hostelley T.L., et al. Préparation et analyse d’échantillons de données d’expression génique basées sur RNASeq de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2017)

L’article décrit un protocole pour générer des embryons de poisson-zèbre par accouplement naturel et tri de leurs stades de développement. Le protocole est également utilisé pour l’analyse des cellules β pancréatiques à l’aide de poissons transgéniques.

Protocole

1. Génération d’embryons par accouplement naturel

1. Cultiver des embryons jusqu’à l’âge de 3 mois, maturité reproductive.
2. Séparez les poissons mâles et femelles adultes de la souche désirée dans des bassins d’accouplement divisés la veille de la collecte des embryons, et ajoutez 2 mâles et 3 femelles dans chaque bassin.
   REMARQUE : L’utilisation de la souche rapporteuse fluorescente transgénique insulin2a :mCherry a permis l’analyse des cellules β pancréatiques.
3. Transférez les poissons dans le bassin d’accouplement avec de l’eau fraîche du système et retirez le séparateur immédiatement après l’allumage des lumières le lendemain matin.
4. Laissez les poissons s’accoupler naturellement jusqu’à ce que les embryons soient observés dans l’aquarium de fond. Prélevez les embryons à intervalles de 30 minutes jusqu’à ce que la quantité souhaitée soit recueillie. Conservez chaque point temporel collecté dans des boîtes de Pétri séparées dans un milieu embryonnaire à 28,5 °C.
5. Effectuer une micro-injection de matériel génétique ou un placement dans un milieu de culture expérimental, si désiré, et cultiver les embryons dans un milieu embryonnaire frais de Hank dans des boîtes de Pétri de 10 cm à 28,5 °C
   REMARQUE : Pour l’analyse de l’expression génique chez les animaux injectés de morpholino (MO) ou mutants, notez que chaque manipulation peut avoir des impacts accessoires sur l’expression des gènes. Les mutants peuvent présenter une compensation génétique au niveau de transcription qui n’est pas observée par le ciblage génique basé sur MO.

2. Embryons au stade

1. Cultivez les embryons en groupes de 50 à 75 embryons par boîte de Pétri de 10 cm pour favoriser un calendrier de développement cohérent de tous les embryons.
2. Surveiller la morphologie du développement à l’aide d’un microscope de dissection aux stades du blastomere, de l’épibole et du somite pour assurer la progression du développement.
   REMARQUE : Retirez tous les embryons mourants ou malformés pour éviter le retard de développement dans la boîte.
3. Séparez les embryons en fonction de l’âge de développement. Stades stabilisés des embryons et des larves en utilisant la longueur totale du corps après 24 hpf.
   REMARQUE : Les somites sont le tissu mésodermique en forme de chevron présent sur la partie dorsale de l’embryon.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ins2a :mCerise	ZIRC	ZL1483
Réservoirs d’accouplement 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Microscope de dissection	Zeiss