1. Préparation des échantillons
- Préparation du mélange d’agarose
- 15 min avant la préparation du mélange d’agarose, faire fondre une aliquote de 1 ml d’agarose à bas point de fusion à 1 % (dissoute dans un milieu E3) dans un bloc chauffant réglé à 70 °C. Une fois que l’agarose est complètement fondue, transférez 600 μl dans un tube frais de 1,5 ml, ajoutez 250 μl de milieu E3, 50 μl de MS-222 à 0,4 % et 25 μl de solution mère de billes vortex.
note: Cela fait 925 μl du mélange, tandis que 75 μl supplémentaires sont calculés pour le liquide ajouté plus tard avec les embryons.
- Conservez le tube dans un deuxième bloc chauffant à 38-40 °C ou assurez-vous que l’agarose est très proche de son point de gélification avant d’y placer des embryons échantillons.
- Montage des embryons
- Prenez cinq capillaires en verre d’un volume de 20 μl (avec une marque noire, ~1 mm de diamètre intérieur) et insérez-y les pistons en téflon correspondants. Poussez le piston à travers le capillaire de manière à ce que l’embout en téflon se trouve au bas du capillaire.
- Transférez cinq embryons (un nombre qui peut être monté en une seule fois) à l’aide d’une pipette en verre ou en plastique dans le tube d’un mélange d’agarose chaude vortex à 37 °C.
note: Essayez de transporter un volume minimum de liquide avec les embryons.
- Insérez le capillaire dans le mélange et aspirez un embryon à l’intérieur en tirant le piston vers le haut. Assurez-vous que la tête de l’embryon pénètre dans le capillaire avant la queue. Évitez toute bulle d’air entre le piston et l’échantillon. Il doit y avoir ±2 cm d’agarose au-dessus de l’embryon et ±1 cm en dessous. Répétez l’opération pour les embryons restants.
- Attendez que l’agarose se solidifie complètement, ce qui se produit en quelques minutes, puis stockez les échantillons dans un milieu E3, en les collant à la paroi d’un bécher avec de la pâte à modeler ou du ruban adhésif. L’ouverture inférieure du capillaire doit être suspendue librement dans la solution, ce qui permet l’échange gazeux avec l’échantillon.
REMARQUE : Un protocole similaire aux sections 1.1 et 1.2 peut également être trouvé sur la page wiki OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.
2. Positionnement de l’échantillon
- Ensemble de support d’échantillon
- Insérez 2 manchons en plastique de la bonne taille (noirs) l’un contre l’autre dans la tige du porte-échantillon. Leurs côtés fendus doivent être tournés vers l’extérieur. Fixez la vis de serrage sans serrer en la tournant de 2 à 3 tours. Insérez le capillaire dans la vis de serrage et poussez-le à travers le support jusqu’à ce que la bande de couleur noire devienne visible de l’autre côté. Évitez de toucher le piston.
- Serrez la vis de serrage. Poussez l’excès de 1 cm d’agarose sous l’embryon hors du capillaire et coupez-le. Insérez la tige dans le disque du porte-échantillon.
- Vérifiez dans le logiciel que la platine du microscope est en position de charge. À l’aide de rails de guidage, l’ensemble du support avec l’échantillon verticalement vers le bas dans le microscope est utilisé. Tournez-le de manière à ce que le disque de support magnétique se verrouille en position.
