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1. Préparation des embryons
- Après l’accouplement, récoltez les embryons en E3 dans une boîte de Pétri et incubez-les à 26,5 °C pendant environ 28 h avant de les monter.
note: Cela ralentit le développement des embryons, de sorte que les embryons sont environ à 30 somites au début de l’imagerie.
- Anesthésie les embryons dans 0,016-0,020 % de tricaïne dans E3. Pour inhiber la pigmentation, ajoutez du PTU à une concentration de 200 μM.
- Déchorionner les embryons à l’aide d’une pince sous un microscope à dissection. À l’aide de deux pinces, saisissez et écartez doucement le chorion pour libérer l’embryon.
2. Montage en agarose
REMARQUE : La méthode de montage développée nécessite deux concentrations différentes d’agarose à bas point de fusion dans E3 avec 0,02 % de tricaïne et de PTU selon les besoins. La première solution d’agarose contient une concentration optimale d’agarose à laquelle la distorsion et la motilité sont au minimum. L’optimisation est décrite à l’étape 5 ci-dessous.
- Chauffer les solutions d’agarose pour les deux couches (concentration définie à l’étape 5 ci-dessous et 1 %) à 65 °C. Laissez l’agarose refroidir à environ 30 °C juste avant le montage afin que l’embryon ne soit pas endommagé par la chaleur. Pour le montage, utilisez des plats à fond en verre de 35 mm avec un fond en verre de couverture n° 0. Le verre de couverture fixé au fond de la boîte crée un puits peu profond de 10 mm (environ 1,2 mm de profondeur), dans lequel l’embryon doit être placé.
note: Dans ce cas, la concentration avec le moins de motilité et de distorsions était comprise entre 0,025 et 0,040 % d’agarose.
- Placez délicatement un embryon déchorionné avec l’un de ses côtés latéraux vers le fond de la boîte à l’aide d’une pipette en verre ou d’une micropipette. Si vous utilisez une micropipette, coupez la partie externe de l’extrémité pour augmenter la taille de l’ouverture afin qu’elle s’adapte à l’embryon (figure 1A). Retirez délicatement tout E3 restant à l’aide d’une micropipette.
- Ajouter la première solution d’agarose dans le petit puits créé par le verre de couverture fixé au fond de la boîte pour couvrir l’embryon (couche 1) (figure 1B). Assurez-vous que l’agarose recouvre le petit puits mais ne le fera pas déborder.
- Couvrir le petit puits à l’aide d’un verre de protection (22 mm x 22 mm) (figure 1C) pour créer un espace étroit rempli d’agarose avec l’embryon entre les deux verres de couverture.
- Placez une couche de solution d’agarose à 1 % sur le dessus du verre de couverture sur tout le fond du plat (couche 2) (Figure 1D). Au fur et à mesure que cette couche se solidifie, elle maintient le verre de protection en place.
- Remplissez la partie restante de la boîte avec de l’E3 contenant 0,02 % de tricaïne pour maintenir le système hydraté (couche 3) (figure 1E).
note: Dans cette configuration, le verre de protection et 1 % d’agarose protègent la couche inférieure contre la dilution.
3. Optimisation de la solution d’agarose pour la couche 1
- Pour déterminer la concentration optimale d’agarose pour la couche 1, utilisez une approche de recherche par grille multi-échelle. Monter les embryons dans des concentrations croissantes d’agarose allant de 0,01 % à 1 %, suivi d’une imagerie en accéléré de la croissance embryonnaire, de la restriction et de la motilité de l’embryon dans le champ de vision. Identifiez les concentrations où la distorsion et la motilité sont au minimum.
- Pour optimiser davantage la concentration d’agarose, montez les embryons en utilisant une gamme plus fine de concentrations d’agarose (par exemple, entre 0,025 et 0,040 % d’agarose) en fonction de la concentration jugée la meilleure à l’étape 3.1 (par exemple, 0,025 %, 0,028 %, 0,031 %, etc.).
note: Dans notre laboratoire, la concentration optimale d’agarose était d’environ 0,03 %.