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1. Configuration du microscope, acquisition, traitement et analyse des images
- Préparez de l’agarose à 0,8 % à bas point de fusion (LMP) : Ajouter 0,8 g d’agarose LMP à 100 ml d’E3 et chauffer jusqu’à dissolution complète. À chaud, aliquote 1 ml d’agarose LMP dans des tubes microfuges de 1,5 ml dans un bloc chauffant à 37 °C. L’agarose LMP restera fondue à 37 °C. Ajouter 40 μl de tricaïne à 4 mg/ml (25x), pH 7,0 à chaque aliquote de 1 ml d’agarose LMP à 37 °C. REMARQUE : Si vous travaillez avec une souche pigmentée, ajoutez 20 μl de PTU à 0,15 % (50x) à chaque aliquote de 1 ml.
- Conservez l’agarose LMP restante pendant plusieurs mois dans des tubes scellés de 50 ml à 4 °C.
- Anesthésier les embryons parabiotiques à imager en ajoutant 1 ml de tricaïne à 4 mg/ml (25x), pH 7,0 aux 25 ml d’E3 dans lesquels les embryons se trouvent déjà.
- Agitez doucement le plat pour que les embryons s’accumulent au milieu. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique à pointe large, aspirez les embryons dans le moins de liquide possible. Tournez la pipette à la verticale et faites rebondir doucement les embryons pour qu’ils se déposent tout au fond de la pipette.
- Avec les embryons au bas de la pipette, transférez-les dans une aliquote de 1 ml d’agarose LMP en touchant légèrement la pointe de la pipette à la surface de l’agarose. Évitez de transférer l’excès de liquide car cela diluerait l’agarose.
- Après avoir expulsé l’excès de liquide de la pipette, utilisez la pipette pour mélanger délicatement les embryons dans l’agarose, puis utilisez la pipette pour transférer toute l’agarose et les embryons dans le puits d’une plaque à fond de verre (n° 1,5), plaque à 6 puits.
note: Assurez-vous de jeter la pipette après avoir transféré les embryons sur la plaque d’imagerie. L’agarose résiduelle se déposera à l’intérieur de la pipette, la rendant inefficace pour une utilisation ultérieure. Utilisez plutôt une nouvelle pipette à chaque fois.
- Sous un stéréoscope, à l’aide d’une pointe de pipette à chargement de gel fixée à l’extrémité d’une aiguille de taquinerie à manche en bois, positionner les embryons vers le bas vers le verre de protection (pour s’assurer qu’ils se trouvent à la distance de travail de l’objectif du microscope) et dans l’orientation souhaitée pour l’imagerie.
note: Repositionnez continuellement jusqu’à ce que l’agarose ait complètement pris. Prenez soin de monter les embryons parabiotiques en fonction de l’embryon de la paire à imager. Étant donné l’orientation aléatoire des embryons siamois, pour certaines paires, il peut être difficile d’imager les deux embryons. Dans ce scénario, récupérez les embryons de l’agarose à l’aide d’une pince et d’une pipette de transfert en plastique à pointe large, puis remontez pour l’imagerie sous un angle différent.
- Une fois l’agarose pris, recouvrez de 2 à 3 ml d’E3 complété par de la tricaïne (et du PTU si nécessaire).
- Imagez les embryons à l’aide d’un microscope confocal à épifluorescence à champ large inversé, d’un microscope confocal à balayage laser ou d’un microscope confocal à disque rotatif. Sélectionnez l’objectif le plus approprié pour l’imagerie souhaitée. Pour un champ de vision de l’embryon entier, utilisez un objectif 4x. Sélectionnez un grossissement plus élevé, tel qu’un objectif 20x, pour imager un tissu spécifique
note: Si vous utilisez un microscope vertical, montez l’agarose LMP (similaire à ci-dessus) sur une lamelle en verre. Retournez la lamelle en verre sur une lame de microscope en verre dont l’anneau de graisse sous vide est rempli du même E3-tricaïne-PTU.
- Traitez les images acquises à l’aide de logiciels d’analyse d’images gratuits tels que NIH Image J/FIJI.
note: Comptez le nombre de cellules et quantifiez les dynamiques telles que la migration et la division cellulaires à l’aide d’algorithmes de segmentation et de suivi.