1 : Axotomie à deux photons à l’aide d’un microscope à deux photons construit sur mesure avec un laser Chameleon Ti-Sapphire
- Préparez-vous pour l’imagerie. Placez le(s) embryon(s) monté(s) sur un porte-lames sous le microscope. Concentrez-vous sur un embryon avec un objectif d’eau 40X (0,8 NA). Allumez le laser. Nous avons été en mesure de visualiser et d’endommager de manière reproductible les neurones exprimant la GFP en utilisant les paramètres suivants. Pour visualiser les axones à une puissance non dommageable, réglez le laser sur une longueur d’onde de 910 nanomètres (nm) et une puissance de 30 milliwatts (mW indiqué sont la quantité de puissance sur l’échantillon). Ouvrez le logiciel d’imagerie. Nous utilisons le logiciel ScanImage développé dans le laboratoire de Karel Svoboda.
- Appuyez sur focus pour scanner l’embryon avec le laser à deux photons, localisez l’axotomie que vous souhaitez axotomiser et capturez une image de cet axone. Marquez la première et la dernière position Z, acquérez l’image et faites une projection maximale des piles Z.
- Zoomez 70X sur la branche de l’axotomie que vous souhaitez axotomiser et arrêtez le balayage. Augmentez le mW au niveau de l’échantillon jusqu’à la puissance dommageable de 180 mW et effectuez un seul balayage avec le laser. Pour ce faire, nous réglons le nombre de tranches Z sur 1 et appuyons sur « Saisir ». Cela devrait suffire à sectionner l’axone. Voir la discussion pour les méthodes permettant d’optimiser cette procédure pour votre microscope et votre objectif expérimental.
- Faites un zoom arrière, réduisez la puissance à 30 mW et prenez une image.
2 : Axotomie à deux photons sur microscope confocal/biphoton Zeiss 510
- Placez l’embryon monté sur la scène et mettez-le au point à l’aide d’un objectif à eau 25X ou d’un autre objectif approprié.
- Allumez les lasers à deux photons (910 nm) et à argon (488 nm) en mode multipiste afin qu’il soit possible de passer de l’un à l’autre. Bien que les deux lasers soient utilisés pour détecter la GFP, l’émission à deux photons est visualisée en rouge et l’émission laser à l’argon en vert pour différencier les deux.
- Utilisez le laser Argon pour identifier un axone à blesser. Sous les paramètres Z, marquez la première et la dernière section optique. Prenez une image confocale et créez une projection maximale de la pile Z.
- Choisissez la région de l’axone à blesser et mettez l’accent sur cette région. Éteignez le laser à argon et allumez le laser à deux photons. Scannez l’échantillon avec les deux photons à une intensité laser de ~9 % de transmission pour vous assurer que l’axone est toujours au point.
- Cliquez sur le bouton « stop » pour que l’outil de recadrage soit disponible. Utilisez le recadrage pour zoomer sur la zone d’intérêt. Habituellement, nous zoomons à ~70X (le zoom peut être vérifié sous l’onglet « mode »). Sous l’onglet « canaux », changez l’intensité des deux photons de ~9 % de transmission à 15-20 % de transmission.
- Pour sectionner un axone, activez le bouton « XY rapide » pendant environ 1 seconde, puis appuyez sur le bouton d’arrêt pour éviter des dommages excessifs. L’axone doit être considéré comme un débris dispersé si la procédure a fonctionné.
- Pour vous assurer que l’axone a été endommagé, revenez au laser Argon de 488 nm, prenez une autre image confocale et créez une projection maximale.
