$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Monter les larves pour les expériences comportementales
- Préparez 1,5 % d’agarose à bas point de fusion dans du ddH2O et conservez-le dans un bloc thermique à 42 °C pour éviter qu’il ne se solidifie.
- À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférez l’une des larves présélectionnées dans un tube d’agarose à faible point fondu à 1,5 % avec le moins d’eau bleue/embryonnaire possible.
- Transférez les larves dans une goutte d’agarose sur une petite boîte de Pétri.
- Sous un microscope à dissection, positionner la larve dorsale vers le haut.
- Lorsque l’agarose s’est solidifiée, coupez l’agarose avec une fine lame de rasoir (scalpel #11), en laissant un coin de gélose autour de la larve entière.
- Faites deux entailles diagonales de chaque côté du jaune, en prenant soin de ne pas entailler la larve.
- Remplissez la zone entourant l’agarose avec de l’embryon/de l’eau bleue.
- Tirez l’agarose loin du tronc et de la queue de la larve (figure 1).
2 . Préparation d’un appareil photo haute vitesse et d’un logiciel d’imagerie
- Montez la caméra haute vitesse sur la lunette de dissection.
- Connectez l’appareil photo à l’ordinateur.
- Allumez l’ordinateur.
- Allumez l’appareil photo haute vitesse.
- Ouvrez un logiciel de vidéo/imagerie (nous utilisons le logiciel d’imagerie AOS et décrirons les procédures d’utilisation ici, mais d’autres logiciels d’imagerie sont tout aussi acceptables).
- Ajustez les paramètres de l’appareil photo en conséquence (c’est-à-dire 1 000 images par seconde (fps), 50 % de mémoire tampon de déclenchement ou d’autres paramètres préférés).
- Démarrez l’enregistrement.
3. Activer des neurones uniques à l’aide d’un laser de 473 nm
- Fixez le stimulateur, le laser et le câble optique.
- Allumez le stimulateur.
- Réglez le stimulateur sur un maximum de 5 volts et une durée d’impulsion de 5 ms.
- Allumez le laser conformément aux instructions du fabricant.
- À l’aide d’un microscope à dissection, l’extrémité du câble optique est placée près du corps cellulaire d’un neurone présentant l’expression de ChEF-tdTomato (Figure 1).
- Délivrez une impulsion de lumière bleue pour activer le neurone sensoriel.
- Enregistrez le comportement à l’aide d’une caméra haute vitesse réglée à 500 ou 1 000 images par seconde.
- Répétez l’expérience comme vous le souhaitez, en attendant 1 minute entre chaque activation pour éviter l’accoutumance. (Nous enregistrons un minimum de trois réponses pour chaque neurone).
- Pour libérer les larves, séparez l’agarose à l’aide d’une pince en prenant soin de ne pas blesser l’animal. On peut laisser cet animal se développer davantage et la procédure peut être répétée à un stade plus ancien pour caractériser le développement du comportement. L’embryon peut également être remonté pour une imagerie confocale à haute résolution de la cellule activée afin de corréler le comportement avec la structure cellulaire, comme décrit ci-dessous.
- Transférer la larve dans une plaque de culture avec de l’eau bleue fraîche/embryonnaire. Nous utilisons une plaque de 24 puits pour suivre les larves individuelles.