Dissection du cristallin : une technique pour observer la morphologie du cristallin du poisson-zèbre

Résumé

Source : Vorontsova I. et al, Évaluation de la localisation du noyau du cristallin du poisson-zèbre et de l’intégrité suturale. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit le protocole qui est développé pour disséquer les lentilles de poisson-zèbre adultes et larvaires afin d’analyser la morphologie du cristallin cortical et l’intégrité structurelle des sutures du cristallin.

Protocole

1. Dissection de lentilles de poisson-zèbre larvaire et adulte

1. Anesthésier les poissons à partir de 6 dpf larves jusqu’à l’âge adulte avec de la tricaïne jusqu’à ce qu’ils ne répondent plus au toucher mais montrent toujours un rythme cardiaque fort. Mesurer la longueur standard du poisson selon Schilling (2002) pour la mise en scène.
2. Exciser immédiatement les yeux à l’aide de ciseaux de micro-dissection et les placer dans une boîte de dissection en PBS (figure 1 pour les yeux adultes).
   1. Fabriquez une parabole personnalisée de 35 mm remplie de silicone pour les dissections de lentilles. Une fois que le silicone a pris, excisez un divot d’environ 2-3 mm de diamètre et 0,5 mm de profondeur pour immobiliser les yeux/lentilles adultes pendant la dissection.
3. Dissection des lentilles de poisson-zèbre adulte
   1. Placez un œil d’adulte dans le plat divot postérieur vers le haut rempli de PBS. Immobiliser l’œil en insérant une pince à un angle de <45° à travers le disque optique. Veillez à ne pas entailler ou comprimer l’objectif. Faites deux ou trois incisions radiales à travers la rétine et la sclérotique du disque optique à la zone ciliaire avec des ciseaux de dissection.
   2. Retirez la rétine et la sclérotique comme des pétales de fleur et retournez l’œil, côté cornée vers le haut. Immobiliser le cristallin indirectement en manipulant la sclérotique et la cornée avec le côté plat des ciseaux, tout en retirant la rétine et les tissus attachés avec des pinces. Coupez soigneusement l’excès de tissu de l’objectif.
      note: Il est essentiel de disséquer soigneusement pour obtenir des lentilles toujours saines.
4. Dissection de larves de lentilles de poisson-zèbre
   1. Placez une larve de l’œil postérieur vers le haut sur la partie plate de la boîte en silicone remplie de PBS et utilisez une aiguille en tungstène aiguisée pour faire des coupes radiales à travers la rétine et la sclérotique tout en immobilisant l’œil avec une autre aiguille en tungstène ou une >note: Veillez à ne pas endommager l’objectif.
      1. Affûtez électrolytiquement la pointe d’un fil de tungstène de 2 cm de long en suspendant la pointe du fil dans 10 % (w/v) de NaOH et en appliquant un courant alternatif basse tension14. Fixez l’aiguille dans une pipette Pasteur en faisant fondre l’extrémité du verre à l’aide d’un bec Bunsen.
         note: D’autres outils de dissection fine peuvent également être utilisés.
         prudence: Le NaOH est corrosif.
   2. Retirez doucement le cristallin de l’œil dissocié avec un côté émoussé de l’aiguille et retirez soigneusement les tissus attachés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Boîte à micropuits à fond en verre (boîte de Pétri de 35 mm, micropuits de 14 mm, verre de protection #1.5)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Pince Dumont #5	Dumont & Fils		Gardez les pinces affûtées
Ciseaux de micro-dissection Vannas	Ted Pella Inc	1346	Pointes droites pointues/pointues
Microscope confocal	Nikon		Eclipse Ti-E
Billes d’hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S612-3	ATTENTION - corrosif/irritant pour les yeux et la peau, organe cible - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 sur 2 système respiratoire, corrosif pour les métaux
Pipettes jetables en verre Pasteur	Fisherbrand	Référence 13-678-20A