Électrophysiologie par patch clamp de cellules entières : une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones

Résumé

Source : Roy, B., et al. Enregistrements de patchs clamps à partir de cellules embryonnaires de poisson-zèbre Mauthner. J. Vis. Exp. (2013).

Ce protocole décrit une technique appelée électrophysiologie par patch clamp à cellules entières, qui est une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones de Mauthner et d’autres cellules réticulospinales dans les embryons de poisson-zèbre.

Protocole

1. Enregistrement par patch clamp (mode cellule entière)

1. Tous les enregistrements sont effectués en mode de patch clamp de cellule entière. Les chambres d’enregistrement sont placées sur une platine de microscope dans un dispositif d’électrophysiologie. Nos platines sont fixes et le microscope à pince de patch droit est boulonné à une plate-forme de microscope mobile ou à un traducteur de microscope.
2. Les pipettes à pince patch sont tirées sur un extracteur horizontal (P-97 ; Sutter Instruments Co.) en verre borosilicate à paroi mince obtenu à partir de WPI. Le diamètre de la pointe de la pipette est de l’ordre de 0,2 à 0,4 μm après polissage au feu jusqu’à obtenir un bord lisse, et le cône de la tige mesure ~4 mm de longueur.
3. Fixez la pipette à la tête de l’amplificateur dans la configuration d’électrophysiologie. Il est important de maintenir l’étage de tête à un angle d’environ 45° par rapport à l’axe horizontal, car cela garantit un angle d’entrée pour la pipette adapté à la formation de joints à haute résistance sur la cellule Mauthner.
4. Juste avant d’entrer dans la solution du bain, appliquez une petite quantité de pression positive sur la pipette pour réduire le risque de salir l’embout. Lors de l’enregistrement des mEPSC, les solutions de bain comprennent 1 μM de TTX pour bloquer les potentiels d’action, 5 μM de strychnine pour bloquer les récepteurs de la glycine et 10 μM de bicuculline ou 100 μM de picrotoxine pour bloquer les récepteurs GABAA. Lors de l’enregistrement des mIPSC, les solutions de bain comprennent 1 μM de TTX, de l’acide kynurénique et de la bicuculline ou de la strychnine en fonction de l’activité du récepteur d’intérêt.
5. Approchez la cellule M avec une petite quantité de pression positive dans la pipette. La pression positive pousse doucement la cellule d’un côté à l’autre et, lorsqu’elle est positionnée immédiatement au-dessus de la cellule, forme une petite fossette sur la membrane cellulaire. Laissez la pipette en place pendant quelques secondes pour nettoyer délicatement la surface de la cellule afin qu’un joint solide entre la pipette et la membrane puisse se former. La libération de la pression positive dans la pipette permet d’initier le scellage et une petite quantité de pression négative associée à des potentiels de pipette négatifs permet de former des joints GigaΩ en quelques secondes.
6. Modifiez le potentiel de maintien sur l’amplificateur à -60 mV. Rompre la membrane cellulaire avec une série de courtes impulsions d’aspiration. Enregistrez immédiatement les potentiels membranaires et minimisez les artefacts de capacité. Compensent la capacité de la cellule (Cm) et la résistance d’accès (série) (Ra) de 70 à 85 %. Ra doit être surveillé régulièrement, toutes les 30 secondes à une minute, et s’il y a un changement de 20 % ou plus, interrompre l’expérience.
7. Une fois l’expérience terminée et que suffisamment de données ont été acquises, la préparation est sacrifiée en retirant le cerveau postérieur à l’aide d’une paire de pinces. À ce stade, l’analyse des données peut commencer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extracteur de pipette	Sutter Instruments Co	P-97
Microscope à pince de patch droit	Microsystèmes Leica	DMLFSA
amplificateur	Dispositifs moléculaires	200B
Micromanipulateur	Siskiyou Inc.	MX7500