Microinjection d’embryons : une technique pour délivrer un composé dans le jaune de poisson-zèbre

Résumé

Source : Sorlien, E. L., et al. Production efficace et identification des knock-outs de gènes générés par CRISPR/Cas9 dans le système modèle Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit une technique de micro-injection d’embryons pour délivrer des composés dans le sac vitellin du poisson-zèbre.

Protocole

1. Micro-injection de composants CRISPR dans des embryons de poisson-zèbre

1. Installez des bassins de reproduction la nuit précédant l’injection en plaçant le nombre de mâles et de femelles souhaités (généralement 2 femelles et 1 ou 2 mâles) dans un réservoir de reproduction avec un séparateur en place.
2. Préparez une plaque de micro-injection avec 1,5 % d’agarose dans 1 milieu E3 (voir le tableau des matériaux) avec 0,01 % de bleu de méthylène (un fongicide) en versant 35 ml d’agarose fondue dans une boîte de Pétri de 10 cm et posez doucement un moule en plastique pour créer des auges en forme de coin dans la solution, en tapotant le moule pour éliminer les bulles d’air.
3. Laissez l’agarose prendre et conservez le plat avec une petite quantité de support et enveloppé dans un film de paraffine pour éviter que la plaque ne se dessèche à 4 °C
   note: Les plaques d’injection sont réutilisables pendant plusieurs semaines, jusqu’à ce que les puits se déforment ou s’assèchent, ou que la plaque commence à moisir.
4. Le matin de l’injection, décongelez l’ARNsg purifié et la protéine Cas9 sur de la glace. N’oubliez pas de manipuler tous les matériaux avec des gants pour éviter la contamination par la RNase et d’utiliser des embouts et des tubes sans RNase.
5. Générer une solution d’injection de 5 μL en combinant la protéine Cas9 et l’ARNsg dans un rapport de 2:1 de Cas9 :ARNsg pour obtenir des concentrations finales de 400 pg/nL de protéine Cas9 et de 200 pg/nL d’ARNsg. Incuber la solution Cas9/ARNsg à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre au Cas9 et à l’ARNsg de former un complexe ribonucléoprotéique. Ajouter 0,5 μL de solution de rouge de phénol à 2,5 % en poids/vol (voir le tableau des matériaux) et de l’eau exempte de RNase à un volume final de 5 μL.
   note: Il a été démontré que la force ionique de la solution affecte la solubilité du complexe Cas9/ARNsg, donc l’ajout de KCl peut augmenter l’efficacité de coupe des ARNg qui présentent une faible formation d’indel.
6. Fabriquez une aiguille d’injection en tirant un capillaire en verre de 1,0 mm à l’aide d’un extracteur de micropipette. Coupez la pointe de l’aiguille fraîchement fabriquée à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir ou d’une pince pour obtenir une ouverture inclinée qui percera facilement le chorion et le sac vitellin.
7. Placez l’aiguille dans un micromanipulateur fixé à un micro-injecteur avec la source d’air allumée. Au microscope optique, en utilisant le grossissement adapté à l’étalonnage déterminé pour l’appareil particulier, ajustez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille éjecte constamment une solution de 1 nL dans une boîte de Pétri remplie d’huile minérale.
   note: La qualité de l’aiguille est critique. Entraînez-vous à produire une aiguille et à l’injecter dans le sac vitellin des embryons jusqu’à ce que cette compétence soit maîtrisée avant de tenter d’autres expériences.
8. Retirez le séparateur et laissez le poisson se reproduire pendant environ 15 min.
   note: Des temps de reproduction plus longs produiront plus d’embryons, mais l’injection doit être terminée pendant que les embryons sont au stade 1 cellule pour maximiser les chances que la coupe de Cas9 se produise tôt et donc diminuer le mosaïcisme génétique. Les embryons peuvent être injectés à des stades ultérieurs (stades 2 à 4 cellules), mais cela peut éventuellement diminuer le taux de transmission germinale de l’allèle modifié.
9. Récupérez les œufs à l’aide d’une passoire et rincez-les dans une boîte de Pétri de 10 cm à l’aide d’un milieu E3 avec 0,0001 % de bleu de méthylène. Examinez la santé des œufs au microscope optique, en retirant tous les œufs non fécondés et les débris.
10. Mettez de côté 10 à 15 embryons comme témoin non injecté dans une boîte de Pétri séparée et étiquetée.
11. À l’aide d’une pipette de transfert, alignez délicatement les œufs sur la plaque d’injection réchauffée à température ambiante.
12. Sous un microscope de dissection à un grossissement de 2,5X, injectez 1 nL de la solution dans le sac vitellin de chaque embryon pour injecter un total de 400 pg de protéine Cas9 et 200 pg de sgRNA.
    note: Pour augmenter la coupe si vous le souhaitez ou si nécessaire, augmentez la concentration finale de la protéine Cas9 à 800 pg/nL et de l’ARNsg à 400 pg/nL dans la solution d’injection ; Cependant, cela peut également augmenter la coupe hors cible et/ou diminuer la santé de l’embryon. L’efficacité de coupe peut également être augmentée en injectant directement dans la cellule. Cependant, l’injection dans le sac vitellin est techniquement moins exigeante et donne une coupe suffisante pour produire des poissons à forte transmission germinale (>70 % de la progéniture contenant un allèle modifié).
13. Remettez les embryons injectés dans une boîte de Pétri correctement étiquetée, recouvrez-les d’un milieu 1x E3 avec du bleu de méthylène et placez-les dans un incubateur d’embryons réglé à 28 °C.
14. 24 h après la fécondation (hpf), inspectez la santé des embryons injectés, retirez les individus morts ou en développement anormal et changez de milieu (voir figure 1). Vérifier le taux de survie par rapport au témoin non injecté.
    note: Lorsqu’on cible un gène non essentiel, on s’attend à ce qu’une létalité inférieure à 10 % soit observée par rapport au témoin non injecté. Si des niveaux élevés de létalité sont observés dans les populations ayant reçu une injection guide par rapport aux populations témoins non injectées, cela peut indiquer que le gène ciblé est essentiel au développement, ou que des effets hors cible entraînent un échec du développement. Il peut être nécessaire de réduire la quantité de réactifs CRISPR injectés ou de générer un nouvel ARNsg avec des effets hors cible réduits.
15. Remettez les embryons dans l’incubateur et continuez à faire croître les embryons à 72 hpf, en changeant le milieu tous les jours pour maintenir la santé de l’embryon.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Eau sans RNase	N’importe quelle marque		Synthèse d’ARN guides. Thermo Fisher et Qiagen portent tous les deux eau appropriée.
Milieu embryonnaire E3	Fabriqué en interne		Milieux pour l’élevage d’embryons et Fabrication de l’injeciton plate. Recette : http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Bleu de méthylène	Sigma-Aldrich	Référence M9140	Ajouté à 1x milieu E3 pour empêcher la croissance fongique sur les embryons.
Pétri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Stocker les embryons, plaque d’injection moulée
Agarose	Denville	Référence : CA3510-8	Plaque d’injection de coulée, gels d’agarose.
Moule à micro-inection	Outils de science adaptative	TU-1	Pour créer des puits pour retenir les embryons pendant l’injection
Rouge phénol	Sigma-Aldrich	Réf. P0290	Colorant pour la visualisation de l’injection
huile minérale	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Pour calibrer le volume d’injection de l’aiguille.
Pipettes de transfert	N’importe quelle marque		Déplacement des embryons
lame	Thermo Fisher	Référence 11295-10	Coupure d’aiguille d’injection, coupe de queue de poisson adulte.
incubateur			Maintenir les embryons à 28,5 °C.
Extracteur de pipette verticale	David Kopf Instruments	700C	Générez des aiguilles pour l’injection. Instructions supplémentaires pour tirer l’aiguille : http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubes capillaires	Instruments Sutter	Réf. BF100-58-10	Générez des aiguilles pour l’injection.
Pointes pour les microchargeurs	Eppendorf	930001007	Charger la solution dans les aiguilles d’injection
Micro-injecteur	Instruments de précision mondiaux	PV 820	Injection d’embryons.
Microscope de disséquage	Leica		Injection d’embryons.
micro-ondes	N’importe quelle marque		Plaque d’injection de coulée, gels d’agarose.
écaille	N’importe quelle marque		Plaque d’injection de coulée, gels d’agarose.
Gants	N’importe quelle marque		Pour tous les aspects du protocole.
N2	N’importe quelle marque		Pour expulser le liquide du capillaire pour l’injection d’embryons
Tubes de bandelettes PCR	N’importe quelle marque		Pour tous les aspects du protocole.
Embouts de 200 μL	N’importe quelle marque		Pour tous les aspects du protocole.
Pointes de 10 μL	N’importe quelle marque		Pour tous les aspects du protocole.
Micropipettes	N’importe quelle marque		Pour tous les aspects du protocole.