Dissection cérébrale du poisson-zèbre : une technique de neurobiologie du poisson

Résumé

Source : Lopez-Ramirez M. A. et. al., Isolement et culture de neurosphères dérivées du cerveau du poisson-zèbre adulte. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit la technique de microdissection du cerveau d’un poisson-zèbre adulte. Cette méthode permet d’obtenir des neuorosphères dérivées du cerveau entier qui peuvent être étudiées plus avant.

Protocole

1. Dissection du cerveau du poisson-zèbre adulte

1. Préparez un lit de dissection en remplissant une boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm avec des blocs réfrigérants. Placez ensuite le couvercle sur la boîte de Pétri et incubez à -20 °C jusqu’à ce que le gel gèle. Sur le dessus du couvercle, placez un carré de papier filtre propre et enveloppez le papier filtre et la boîte de Pétri d’un film plastique.
2. Nettoyez et stérilisez tous les instruments de microdissection à l’éthanol à 70 % ou à la chaleur avant chaque utilisation. Placez tous les instruments de dissection stérilisés près du microscope de dissection et, juste avant l’euthanasie, placez le lit de dissection sous le microscope avec un éclairage par fibre optique.
3. Collectez 2 poissons-zèbres adultes pour une préparation complète de la neurosphère du cerveau ; et 3 à 4 poissons-zèbres pour générer des neurosphères à partir de régions cérébrales disséquées.
4. Euthanasier le poisson-zèbre adulte (âgé de 8 à 12 mois) en suivant un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. Ensuite, plongez le poisson dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 à 10 secondes et placez-le rapidement dans le lit de dissection suivi d’une décapitation au niveau des branchies à l’aide d’une lame chirurgicale.
   1. Pour euthanasier les animaux, administrez une surdose (300 mg/L) de méthanesulfonate de tricaïne jusqu'à ce que le rythme cardiaque de l'animal ralentisse progressivement et que la circulation cesse, puis immergez-le dans de l'eau glacée.
5. Tournez la tête côté dorsal vers le bas et, à l’aide des ciseaux, faites une coupe longitudinale du côté coupé à la bouche. À l’aide de la pince, exposez la base du crâne et retirez tous les tissus adjacents. Coupez les parois latérales du crâne du début de la moelle épinière vers le tectum.
6. À l’aide des ciseaux, coupez et retirez les nerfs optiques, puis retirez les deux côtés de la partie la plus latérale du crâne au niveau du tectum. Tournez la tête ventrale vers le haut. À l’aide d’une pince, décollez le reste de la partie la plus apicale du crâne.
7. Transférez le cerveau avec la partie restante du crâne dans une nouvelle boîte avec le milieu de dissection (DMEM / F12 avec pénicilline / streptomycine). Nettoyez le tissu cérébral dans le milieu de dissection à l'aide du manche en plastique du micro-couteau, en gardant toutes les structures cérébrales intactes.
8. À partir de ce point, continuez le protocole en utilisant tout le cerveau du poisson-zèbre.
   1. Vous pouvez également adapter ce protocole à des régions cérébrales spécifiques pour générer des neurosphères à partir du cerveau entier d’un poisson-zèbre ou du télencéphale, du tectum/diencéphale ou du cervelet disséqué avec un scalpel frais. Utilisez une lignée transgénique neuronale fluorescente de poisson-zèbre pour disséquer la région cérébrale d’intérêt selon la figure 1.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 1x	Technologies de la vie	Référence 11330-032
Pénicilline-streptomycine	Technologies de la vie	Référence 15140-122
Tricaïne MS-222	sigma	A5040	solution mère de 4 mg/ml