Injection orthotopique : implantation de cellules cancéreuses spécifiques à un tissu dans une souris adulte

Résumé

Source : Katsuta, E., et al. Génération d’un modèle de cancer du sein métastatique orthotopique murin et réalisation d’une mastectomie radicale murine.J. Vis. Exp.(2018).

La vidéo montre la technique d’inoculation orthotopique du cancer du sein dans un modèle murin. Cette technique produit un taux élevé de tumorigenèse avec moins de variabilité dans la taille et la forme de la tumeur par rapport à l’injection sous-cutanée ou non chirurgicale.

Protocole

1. Préparation des cellules (pour 10 souris)

REMARQUE : Les cellules doivent être inoculées dans l’heure qui suit leur détachement de la parabole pour éviter une diminution de la viabilité cellulaire. Plus précisément, la suspension cellulaire doit être mélangée au mélange de protéines gélatineuses dans les 15 minutes suivant le détachement des cellules de la boîte pour maintenir leur viabilité.

1. Cultivez des cellules 4T1-luc2, une lignée cellulaire d’adénocarcinome mammaire de souris exprimant la luciférase, dans un milieu RPMI 1640 avec 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO₂.
2. Laver les cellules 4T1-luc2 adhérentes dans une boîte de 10 cm avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % à l’aide d’une pipette P1000, puis incuber l’échantillon à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 4 ml de milieu de croissance (RPMI-1640 avec 10 % de FBS) à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml dans un capuchon de culture tissulaire. Centrifuger la suspension cellulaire à 180 x g pendant 5 min.
3. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de PBS, puis compter les cellules à l’aide de l’hémocytomètre.
4. Suspendre 2 x 10⁶ cellules 4T1-luc2 dans 40 μL de PBS froid (pH 7,4, 4 °C) dans le capot de culture tissulaire.
5. Mélangez la suspension cellulaire de 40 μL avec 360 μL du mélange de protéines gélatineuses dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace dans la hotte de culture tissulaire.
   REMARQUE : La concentration finale est de 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS :mélange de protéines gélatineuses). Pour le modèle orthotopique (pas de mastectomie), 1 x 10⁴/20 μL de la concentration finale a été utilisé, afin d’éviter d’atteindre les critères d’euthanasie (taille de la tumeur > 2 cm) dans les deux semaines.

2. Inoculation de cellules cancéreuses

1. Placez les souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie avec 2 à 4 % d’isoflurane et un débit d’oxygène de 0,2 L/min jusqu’à ce que les souris respirent calmement (2 à 3 min).
2. Saisissez la souris et injectez 0,05 mg/kg de buprénorphine dans son épaule par voie sous-cutanée.
3. Confirmez l’anesthésie adéquate par l’absence de réaction à un pincement de l’orteil. Insérez le nez de la souris dans le trou du masque de souris, ce qui permet une anesthésie par inhalation avec 2 à 4 % d’isoflurane et un débit d’oxygène de 2 L/min attaché à une unité de cartouche de charbon de bois.
4. Restreignez les membres de la souris à l’aide de ruban adhésif de laboratoire et stérilisez sa peau avec de la chlorhexidine, de l’iode et de l’éthanol à 75 %, à l’aide de cotons-tiges.
5. Faites une incision cutanée de 5 mm au milieu de la paroi thoracique antérieure à l’aide de ciseaux de microdissection stériles, soulevez la peau du côté droit à côté de l’incision et détachez la peau de la paroi thoracique à l’aide des ciseaux, puis inversez la peau pour exposer le coussinet adipeux mammaire #2 droit.
6. Injectez avec précaution 20 μL de suspension de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 28,5 G dans le coussinet adipeux en vision directe à travers la plaie.
   REMARQUE : L’aiguille traverse la plaie, pas la peau. Maintenez l’aiguille dans le coussinet adipeux pendant 5 secondes avant de la retirer, ce qui laisse le temps au mélange de protéines gélatineuses de se solidifier.
7. Fermez les incisions cutanées par suture, à l’aide de sutures stériles 5-0 non résorbables.
8. Après l’opération, remettez les animaux dans une cage propre et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils se soient rétablis et qu’ils se déplacent librement (après ~1 à 2 min). Si l’animal ne semble pas en bonne santé dans les 24 heures suivant l’opération, administrez-lui de la buprénorphine (0,2 mg/kg).
9. Retirer les sutures sous anesthésie (voir étape 2.1) 7 jours après l’intervention.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux de micro-dissection	Roboz	RS-5983	Pour l’inoculation de cellules cancéreuses et la mastectomie
5-0 Sutures en soie	regarder	774B F
Institut commémoratif de Roswell Park 1640	Gibco	11875093	Pour la culture cellulaire
Sérum fœtal bovin	Gibco	10437028	Pour la culture cellulaire
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	Pour la culture cellulaire
Stérilisant sec (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	Pour l’inoculation de cellules cancéreuses et la mastectomie
Porte-aiguille	Roboz	RS-7830	Pour l’inoculation de cellules cancéreuses et la mastectomie
Pince Adson	Roboz	RS-5233	Pour l’inoculation de cellules cancéreuses et la mastectomie
clipper	Wahl	Référence 9908-717	Pour l’inoculation de cellules cancéreuses et la mastectomie
Matrigel	Corning	354234	Pour l’inoculation des cellules cancéreuses