Co-culture 3D avec interaction directe : co-culture de cellules cancéreuses avec des monocytes pour étudier leur interaction

Résumé

Source : Espinoza-Sánchez, et al. Analyse de la communication entre les monocytes et les cellules cancéreuses primaires du sein dans un système tridimensionnel basé sur un extrait de matrice extracellulaire (ECME). J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la co-culture 3D de cellules cancéreuses du sein avec des monocytes pour étudier leur interaction dans un environnement basé sur un extrait de matrice extracellulaire (ECME). Cette méthode permet d’étudier des caractéristiques spécifiques telles que la dégradation du collagène, le recrutement des cellules immunitaires et l’invasion cellulaire.

Protocole

>1. 3D co-cultures avec interaction directe

1. Marquez les cellules BrC et les monocytes avec différents colorants fluorescents avant la culture cellulaire pour permettre un tri indépendant de chaque lignée cellulaire après la culture pour l’analyse de l’expression de l’ARNm et des protéines. Utilisez des dérivés disponibles dans le commerce de la coumarine et de la rhodamine qui traversent librement la membrane cellulaire des cellules vivantes. Un protocole général d’étiquetage est le suivant :
   1. Préparez une monocouche de cellules BrC d’intérêt (2 × 10⁶ cellules dans une fiole de culture de^{25 cm 2}) et remplacez le milieu standard par une solution de travail préchauffée suffisante du colorant fluorescent (1:2 000 du colorant fluorescent dans le milieu de base standard sans aucun supplément). Incuber 30 min à 37 °C dans un environnement humidifié à 5 % de CO₂. Aspirez la solution de colorant et rincez doucement avec suffisamment de 1x PBS. Aspirez le PBS et ajoutez le support standard.
   2. Trypsiniser la monocouche cellulaire avec 2 mL d’une solution de trypsine à 0,05 % et 0,48 mM d’EDTA pendant 5 à 10 min à 37 °C. Ajouter 200 μL de FBS pour arrêter la trypsinisation et 7 mL du milieu correspondant sans suppléments. Remettez les cellules en suspension par pipetage. Prélever une aliquote de 10 μL pour compter les cellules dans une chambre de Neubauer. Poursuivre le protocole de co-culture après le comptage cellulaire.
   3. Granulez les cellules à 430 x g pendant 5 min à RT (effectuez cette opération en premier car les monocytes se développent en suspension). Jeter le surnageant et remettre doucement en suspension les cellules avec 3 mL d’une solution de travail préchauffée du colorant fluorescent (1:2 000 du colorant fluorescent dans un milieu de base standard sans suppléments). Incuber pendant 30 min à 37 °C dans un environnement humidifié à 5 % de CO₂.
   4. Granulez à nouveau les cellules, jetez la solution de travail du colorant et remettez doucement en suspension avec 5 à 7 ml de 1x PBS. Granulez une fois de plus, jetez le PBS et remettez les cellules en suspension dans 5 à 7 ml de milieu standard. Prélever une aliquote de 10 μL de suspension cellulaire pour compter les cellules dans une chambre de Neubauer. Poursuivre le protocole de co-culture après le comptage cellulaire.
2. Réglez la co-culture comme suit : étalez suffisamment d’ECME au fond du puits pour former une couche uniforme dans chaque puits d’un système de lames à 4 puits. Plaque de 20 μL d’une suspension unicellulaire contenant 5 × 10⁵ cellules BrC marquées par puits.
3. Après 15 à 20 min d’incubation à 37 °C, ajouter une suspension de 2,5 x 10⁵ monocytes marqués dans un milieu de dosage de 80 μL (complété par 60 % d’ECME).
4. Laisser l’ECME se solidifier pendant 15 à 20 minutes à 37 °C.
5. Ajouter 1 mL d’un mélange 1:1 de cellules BrC et de milieu de culture de monocytes.
6. Incuber des co-cultures à 37 °C dans un environnement humidifié à 5 % de CO₂ pendant 24 h, 48 h ou 5 jours pour suivre les changements à différents points temporels.
7. Dégrader les protéines ECM pour récupérer les cellules des cultures. Aspirer et jeter le milieu, ajouter 0,5 mL de 1x PBS avec 0,1 % de trypsine et 0,25 % d’EDTA, et incuber pendant 3 h à 37 °C. Après l’incubation, ajouter 0,5 mL de 1x PBS avec 10 % de FBS pour neutraliser la trypsine, et remettre les cellules en suspension en pipetant vigoureusement pour obtenir une suspension unicellulaire.
8. Granulez les cellules à 765 x g pendant 5 min à RT, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 mL de 1x PBS avec 10 % de FBS. Répétez cette étape une fois.
9. Soumettez la suspension cellulaire au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide de l’instrument approprié. S’assurer que les populations finales sont pures à au moins 95 %.
10. Après le tri, laver les cellules avec du PBS stérile, des granulés (430 x g pendant 5 min à RT), et les remettre en suspension dans du PBS stérile 1x. Les cellules peuvent être traitées selon des protocoles spécifiques pour l’isolement de l’ARN ou l’analyse des protéines.
11. Répétez chaque test trois fois, en incluant des cultures 3D de chaque lignée cellulaire individuelle comme témoins.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
U937	Collection de culture de type américain ATCC	CRL-1593.2	Lignée cellulaire monocytaire/lymphome histiocytaire
THP-1	Collection de culture de type américain ATCC	TIB-202	Lignée cellulaire monocytaire/leucémie monocytaire aiguë
MCF-10A	Collection de culture de type américain ATCC	CRL-10317	Lignée de cellules mammaires non transformées
MCF-7	Collection de culture de type américain ATCC	HTB-22	Lignée cellulaire du cancer du sein
MDA-MB-231	Collection de culture de type américain ATCC	HTB-26	Lignée cellulaire du cancer du sein
RPMI 1640 moyen	GIBCO BRL Life Technologies	Référence 11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	Référence 11039-021
Antibiotique/antimycosique	GIBCO BRL Life Technologies	Référence 15240-062	100 μg/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 0,25 μg/ml de Fungizone
Sérum fœtal bovin	GIBCO BRL Life Technologies	Référence 16000-044
Sérum de cheval	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0,05 % trypsine-EDTA 1X	GIBCO BRL Life Technologies	Référence 25300-062
PBS 1X (solution saline tamponnée au phosphate	GIBCO BRL Life Technologies	Référence 20012-027
Facteur de croissance épidermique (EGF)	PeproTech	AF-100-15 (1,00 mg)
insuline	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
Hydrocortisone	SIGMA-ALDRICH	N° H088-5G
Toxine cholérique Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	Réf. C8052-1MG
Matrigel	Corning Inc	356237	Sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), extrait de matrice extracellulaire, Conserver à -20°C jusqu’à utilisation à 4°C
Lame de chambre Lab-Tek avec couvercle (8 puits)	Nalge Nunc International	177402

)