zPDX-Analyse de l’invasivité : étude du comportement invasif des cellules cancéreuses métastatiques dans les xénogreffes d’embryons de poisson-zèbre

Résumé

Source : Ren, J. et al. Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain chez le poisson-zèbre embryonnaire. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit une méthode de micro-injection pour l’administration de cellules cancéreuses du sein dans l’espace périvitellin d’embryons de poisson-zèbre transgénique. Après l’incubation, nous visualisons l’embryon au microscope fluorescent pour observer l’invasion, la dissémination et les métastases des cellules cancéreuses.

Protocole

1. Imagez et analysez le processus métastatique

1. Prélevez plusieurs embryons anesthésiés à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe large et transférez-les dans le fond en verre d’une boîte en polystyrène.
2. Retirez l’excès d’eau et conservez une quantité limitée d’eau d’œuf. Manipulez l’embryon en position avec un outil de boucle de cheveux et placez un couvercle sur le verre.
3. Utilisez un microscope confocal inversé en combinaison avec des objectifs à immersion dans l’eau ou à séchage à longue distance. Positionnez l’embryon de manière à ce que la région d’intérêt soit aussi proche que possible de l’objectif.
4. Effectuez l’imagerie immédiatement après l’anesthésie pour réduire le risque de décès dû à l’évaporation du liquide.
   1. Capturer les signaux des cellules vasculaires marquées EGFP et des cellules tumorales marquées mCherry à la même position sur les embryons pour co-enregistrer les cellules injectées avec des vaisseaux sanguins en fusionnant les deux canaux d’imagerie.
   2. Pour chaque embryon de poisson-zèbre, collectez deux ensembles d’images différents de la région de la tête et de la région de la queue.
5. Quantifier le nombre de cellules disséminées.
   1. Pour les injections dans l’espace périvitellin, comptez le nombre de cellules de chaque poisson qui se sont disséminées de la masse cellulaire vers le corps embryonnaire du poisson dans les régions de la tête et de la queue 4,15 ; les régions sont au-delà des limites de la cavité cardiaque frontalement, au-dessus de la vessie natatoire dorsalement et au-delà de l’ouverture urogénitale caudalement.
   2. Pour l’injection de Doc, comptez le nombre de cellules individuelles qui ont envahi les fibres de collagène de la nageoire caudale de la circulation (MDA-MB-231) ou le nombre d’amas formés par les cellules collectivement (M2) dans le tissu hématopoïétique caudal (TCH) de chaque poisson-zèbre19.
6. Étudiez l’invasion et les métastases plus en détail à l’aide de la microscopie confocale (fortement recommandée).
   1. Utilisez un faible grossissement (objectif 4X) pour imager l’ensemble du corps et obtenir une vue d’ensemble du schéma de dissémination des cellules tumorales.
      REMARQUE : Un grossissement plus élevé (objectifs 20X et 40X) convient à l’étude de l’angiogenèse intra- et péri-tumorale et à la localisation précise des cellules disséminées dans le corps embryonnaire.
   2. Utilisez un laser de 488 nm pour scanner le système vasculaire de l’embryon de poisson-zèbre et un laser de 543 nm pour scanner les cellules tumorales implantées marquées par fluorescence rouge. Obtenez une image de haute qualité en scannant chaque embryon en huit à dix étapes. Scannez et mesurez chaque étape six fois.
7. Replacez soigneusement l’embryon dans l’eau de l’œuf si cela est nécessaire pour d’autres expériences.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette Pasteur à pointe large (0,5-20 μL)	Eppendorf	F276456I
Microscope confocal	Leica	SP5 STED
Stéréomicroscope	Leica	MZ16FA
souche de poisson-zèbre Tg (fli :EGFP)			Aimablement fourni par Dr. Ewa Snaar Jagalska (Institut de biologie, Université de Leiden, Leyde, Pays-Bas)
Plat en polystyrène avec fond en verre	WillCo	GWST-5040
Stéréomicroscope à fluorescence	Leica	M165 FC
Tricaïne (acide 3-aminobenzoïque)	SigmaAldrich	A-5040