1. Décellularisation
REMARQUE : Cette procédure a été adaptée des méthodes précédemment publiées axées sur la décellularisation adipeuse, qui comprenaient le détergent ionique désoxycholate de sodium plutôt que le dodécylsulfate de sodium pour éliminer efficacement l’ADN.
- Le jour 1, retirez les coussinets de graisse mammaire congelés ou les MFP à -80 °C et décongelez-les à température ambiante.
- Une fois décongelés, séchez brièvement les MFP sur une lingette délicate. Pesez les MFP à l’aide d’une balance analytique.
- À l’aide d’une pince avec des ciseaux ou d’un scalpel, divisez le tissu en échantillons de 3 mm x 3 mm x 3 mm pour l’étude de l’ECM intact et le tissu restant pour la production d’hydrogel.
note: Le nombre d’échantillons dépend du nombre de méthodes d’essai, par exemple le prélèvement de deux échantillons est décrit ci-dessous : l’un pour l’enrobage en paraffine (étape 1.5) et l’autre pour la congélation dans un milieu d’enrobage cryostat, si désiré (voir le tableau des matériaux et l’étape 1.6).
- Pesez les mouchoirs. Si vous intégrez de la paraffine pour la section, passez à l’étape 1.5. En cas de congélation dans un milieu d’enrobage de cryostat pour la section, passez à l’étape 1.6.
- Dans une hotte chimique, immergez le tissu dans du formol tamponné neutre à 10 % (voir le tableau des matières) pendant 24 h à 4 °C. Lavez 3 fois dans du PBS pendant 5 minutes chacune. Immerger le tissu dans 30 % de saccharose pendant 48 h à 4 °C.
- Pesez le tissu maintenant que ce morceau a été retiré. Passez à l’étape 1.6.
- Dans une hotte chimique, placez les pièces de l’imprimante multifonction dans une cassette étiquetée préparée avec un support d’enrobage de cryostat. Ajoutez plus de milieu d’enrobage de cryostat pour couvrir le tissu.
- Placez la cassette dans un bécher de 2-méthylbutane (voir le tableau des matériaux) pré-refroidi avec de l’azote liquide. Le bécher doit avoir suffisamment de 2-méthylbutane pour couvrir le fond, mais pas assez pour immerger la cassette car le milieu d’enrobage du cryostat ne doit pas toucher le 2-méthylbutane. Laissez la cassette reposer dans le 2-méthylbutane jusqu’à ce que le milieu d’enrobage du cryostat gèle et devienne opaque.
- Enveloppez la ou les cassettes dans du papier d’aluminium, étiquetez-les et laissez-les à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour le sectionnement.
note: Les tissus placés immédiatement dans le milieu d’enrobage du cryostat ont été sectionnés à 5 μm tandis que les tissus incubés dans le saccharose ont été sectionnés à 30 μm pour conserver la morphologie adipocytaire.
- À l’aide d’une pince, massez manuellement le tissu restant.
note: Les morceaux de tissu peuvent également être placés dans du NBF à 10 % pendant 24 à 48 h, rincés au PBS et laissés dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’ils soient incorporés dans de la paraffine. Après l’enrobage, des sections de 5 μm peuvent être utilisées pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) (voir section 2 ci-dessous).
- Placez les MFP dans des plats de 6 cm avec 5 ml de solution de trypsine à 0,02 % et d’EDTA à 0,05 %. Incuber à 37 °C pendant 1 h. Vaporisez et essuyez la vaisselle avec de l’éthanol à 70 % avant de la placer dans l’incubateur.
- À l’aide de passoires de 0,7 mm, lavez les MFP avec de l’eau désionisée (DI) en versant de l’eau sur le mouchoir trois fois. À l’aide d’une pince, massez manuellement le tissu entre les lavages.
- Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez. Placez les mouchoirs dans un bécher pré-autoclave contenant une barre d’agitation de taille appropriée. Recouvrez les mouchoirs de 60 mL de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol à 3 % (voir le tableau des matières) pour 1 g de mouchoir et remuez pendant 1 h à température ambiante. Utiliser un minimum de 20 ml.
- Versez le tissu et le contenu dans une passoire. Rincez le bécher avec de l’eau DI et versez sur des mouchoirs. Répétez l’opération deux fois de plus. À l’aide d’une pince, massez manuellement le tissu entre les rinçages.
- Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez. Remettez les mouchoirs et les barres d’agitation dans les mêmes béchers et recouvrez de 60 ml d’acide désoxycholique à 4 % pour 1 g de tissu. Remuer pendant 1 h à température ambiante. Utiliser un minimum de 20 ml.
- Versez le tissu et le contenu dans une passoire à mailles. Rincez le bécher avec de l’eau DI et versez sur des mouchoirs. Répétez l’opération deux fois de plus. À l’aide d’une pince, massez manuellement le tissu entre les rinçages.
- Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez.
- Placez les mouchoirs dans le même bécher avec de l’eau DI fraîche complétée par 1 % de pénicilline-streptomycine. Couvrir hermétiquement d’un film de paraffine. Laisser reposer toute la nuit à 4 °C.
- Lavez les passoires et les béchers pour les utiliser le lendemain.
- Le jour 2, égouttez le contenu du bécher dans une passoire. Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez.
- Placez les MFP dans le même bécher avec une barre d’agitation de taille appropriée. Couvrir avec une solution de 60 mL d’éthanol à 4 % et d’acide peracétique à 0,1 % pour 1 g de tissu. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 2 h à température ambiante.
- Versez le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez une pince pour masser manuellement le tissu. Remettez le contenu dans le bécher. Lavez le mouchoir en le recouvrant de 60 ml de 1x PBS pour 1 g de mouchoir. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuez pendant 15 min à température ambiante. Répétez l’opération une fois.
- Versez le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez une pince pour masser manuellement le tissu. Remettez le contenu dans le bécher. Lavez le mouchoir en le recouvrant de 60 mL d’eau DI pour 1 g de mouchoir. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuez pendant 15 min à température ambiante. Répétez l’opération une fois.
- Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez. Versez le tissu et le contenu dans une passoire. Utilisez une pince pour masser manuellement le tissu.
- Remettez le contenu dans le bécher. Couvrir les mouchoirs avec 60 ml de n-propanol à 100 % pour 1 g de mouchoir. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 1 h à température ambiante.
- Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez. Versez le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez une pince pour masser manuellement le tissu.
- Remettez le contenu dans le bécher. Lavez le mouchoir en le recouvrant de 60 ml d’eau DI pour 1 g de mouchoir. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuez pendant 15 min à température ambiante. Répétez l’opération trois fois.
- Versez le tissu et le contenu dans une passoire. Répétez les étapes 2.3 à 2.6 pour recueillir des morceaux de tissu en vue de l’incubation et de la congélation du saccharose dans un milieu d’enrobage cryostat.
- Séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate, essuyez et pesez. Placer dans un tube étiqueté de 15 ml. Congeler à -80 °C pendant la nuit.
