Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Traitement à la bléomycine
- Prévoyez d’injecter de la bléomycine à des souris par voie intratrachéale 14 jours avant la greffe de cellules tumorales.
- Décongeler le bouillon de bléomycine sur de la glace 2 h avant l’injection.
- Une fois décongelée, diluez la bléomycine à la concentration de travail souhaitée (0,02 U/50 μL ou 0,005 U/50 μL) et conservez-la sur de la glace.
note: La concentration de bléomycine dépend de la souche de souris utilisée pour les expériences (tableau 1). Le titrage de la bléomycine chez la souris doit être effectué pour déterminer la dose optimale.
- Préparez l’anesthésie en diluant la kétamine et la xylazine à une concentration finale de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement, à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 27 G, anesthésiez chaque souris en injectant une solution intrapéritonéale de kétamine/xylazine à 100/10 mg/kg respectivement.
- Surveillez la respiration des souris et pincez-vous des orteils. Confirmez l’anesthésie appropriée lorsque la souris ne répond pas au pincement des orteils. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Placez 1 souris à la fois sur une plateforme d’intubation en suspendant ses dents de devant avec le dos contre la plateforme.
- Illuminez le haut du thorax à l’aide d’un illuminateur à fibre optique pour faciliter la visualisation de la trachée. Ouvrez la bouche de la souris et tirez doucement la langue avec une pince plate stérile.
- Utilisez un cathéter intraveineux sans aiguille pour éviter de bloquer la respiration. Placez le cathéter sur la lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée.
- Insérez le cathéter dans la trachée jusqu’à ce que le haut du cathéter atteigne les dents de devant. Confirmez le bon positionnement du cathéter dans la trachée en visualisant la lumière blanche qui brille à travers l’ouverture du cathéter dans la bouche.
- À l’aide d’une pipette, versez 50 μL de bléomycine ou de véhicule (PBS) directement dans le cathéter pour vous assurer que tout le volume est inhalé. Effectuez cette étape dans des conditions stériles.
- Si le cathéter est correctement inséré, la souris inhalera immédiatement le contenu du cathéter. Attendez quelques secondes jusqu’à ce que tout le volume se déplace dans le cathéter. Retirez ensuite le cathéter de la trachée et jetez-le dans une solution d’eau de Javel à 10 %.
note: Le temps moyen par souris pour les étapes 1.7-1.11 est d’environ 5 min.
- Si la souris n’inhale pas le liquide, surveillez attentivement la respiration et ajustez la position du cathéter. Si la souris cesse de respirer, retirez immédiatement le cathéter et laissez-la respirer normalement avant de réinsérer le cathéter.
- Placez la souris injectée sur un coussin chauffant approuvé par l’IACUC sur son dos sur une surface plane pour la récupération. L’ensemble de la procédure prendra 10 minutes par souris. Ne retournez pas un animal qui a subi une injection à la compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
- Placez une carte « Produit chimique dangereux en cours d’utilisation » sur la cage pendant 24 h.
2. Greffe de lignées cellulaires d’adénocarcinome pulmonaire
REMARQUE : Effectuer la greffe de cellules 14 jours après l’injection de bléomycine (étape 1.1)
- Laisser les cellules se développer dans des flacons de75 cm 2 sans être dérangées pendant 3 jours avant le jour de l’injection avec le milieu correspondant comme indiqué à l’étape 1.3.
note: Ils doivent être confluents à 80 % le jour de l’injection (ce qui correspond à 2-3 x 106 dans chaque fiole selon la lignée cellulaire).
- Laver les cellules en croissance surdes flacons de 2 de 75 cm avec 5 mL de PBS à température ambiante.
- Aspirez du PBS et ajoutez 1,5 mL de trypsine aux cellules et incubez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent (généralement 2 à 5 min).
note: Nous recommandons de vérifier toutes les 2 minutes le détachement de la cellule du plastique par simple visualisation du fond du ballon ou au microscope optique. Ne pas dépasser 5 min d’incubation avec la trypsine.
- Neutralisez la trypsine en ajoutant 4 ml de milieu contenant 10 % de FBS (même milieu que à l’étape 2.1). Recueillir les cellules dans un tube de 15 mL et le centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de PBS pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min à température ambiante sur des cellules en granulés. Répétez cette opération 1 fois.
- Aspirer le PBS et remettre la pastille en suspension dans 1,5 mL de PBS par flacon.
- Mélangez 50 μL de mélange cellulaire avec 50 μL de bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules/chambre d’hémocytomètre.
- Préparez la suspension cellulaire en diluant les cellules dans du PBS pour injecter 1 x 105 cellules (ou toute autre quantité indiquée) dans 50 μL par souris. Gardez les cellules sur de la glace avant l’injection.
note: Préparez au moins deux fois plus de cellules pour l’injection afin d’éviter de manquer de cellules en suspension.
- Préparez l’anesthésie en diluant la kétamine et la xylazine à une concentration finale de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement, à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 27 G, anesthésiez chaque souris en injectant une solution intrapéritonéale de kétamine/xylazine à 100/10 mg/kg respectivement.
- Surveillez la respiration des souris et pincez-vous des orteils. Confirmez l’anesthésie appropriée lorsque la souris ne répond pas au pincement des orteils. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Placez 1 souris à la fois sur une plateforme d’intubation en suspendant ses dents de devant avec le dos contre la plateforme.
- Illuminez le haut du thorax à l’aide d’un illuminateur à fibre optique pour faciliter la visualisation de la trachée.
- Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette p200 pour vous assurer qu’elles ne forment pas d’amas Ouvrez la bouche de la souris et tirez doucement la langue avec une pince plate stérile.
- Utilisez un cathéter intraveineux avec l’aiguille retirée pour éviter de bloquer la respiration. Placez le cathéter sur la lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée.
- Insérez le cathéter dans la trachée jusqu’à ce que le haut du cathéter atteigne les dents de devant. Confirmez le bon positionnement du cathéter dans la trachée en visualisant la lumière blanche qui brille à travers l’ouverture du cathéter dans la bouche.
- À l’aide d’une pipette, versez 50 μL de cellules directement dans le cathéter pour vous assurer que tout le volume est inhalé. Effectuez cette étape dans des conditions stériles.
note: Si le cathéter est correctement inséré, la souris inhalera immédiatement le contenu du cathéter.
- Attendez quelques secondes jusqu’à ce que tout le volume descende dans le cathéter, puis retirez le cathéter de la trachée et jetez-le dans une solution d’eau de Javel à 10 %.
- Si la souris n’inhale pas le liquide, surveillez attentivement la respiration et ajustez la position du cathéter. Si la souris cesse de respirer, retirez immédiatement le cathéter et laissez-la respirer normalement avant de réinsérer le cathéter.
note: Le temps moyen par souris des étapes 2.11 à 2.18 est d’environ 5 min.
- Placez la souris injectée sur un coussin chauffant approuvé par l’IACUC sur son dos sur une surface plane pour la récupération.
note: L’ensemble de la procédure prendra 10 minutes par souris. Ne retournez pas un animal qui a subi une injection à la compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
- Rasez toute la zone des côtes ventralement et dorsalement de B6129SF1/J et d’autres souches de souris à poils foncés à l’aide d’un rasoir électrique avant l’imagerie.
- 2 à 3 minutes après l’injection de la cellule, injecter 100 μL de luciférine par voie rétro-orbitaire (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille à insuline. Alterner l’œil utilisé pour l’injection à chaque séance d’imagerie.
- Après au moins 2 min, placez jusqu’à 5 souris dans un imageur de bioluminescence animale en position couchée dorsale et acquérez une image ventrale à l’aide des paramètres de luminescence
.
- Sous le panneau de configuration, ajustez les paramètres de résolution et de sensibilité pour mesurer la luminescence d’une lignée cellulaire donnée. Pour la plupart des applications, commencez par 3 min (ou « Auto » si saturé), binning=Medium (4), F/Stop=1, Champ de vision=D, Hauteur du sujet=1.50.
note: Si l’injection réussit, un signal de luminescence est détecté dans la partie supérieure du thorax, dans un poumon ou dans les deux poumons.
- Retournez les souris en position de décubitus sternal et obtenez une image dorsale comme ci-dessus.
note: Si l’injection cellulaire n’est pas effectuée correctement, les cellules peuvent se regrouper à l’entrée de la trachée ou dans le cou.
- Injecter du kétoprofène 5 mg/kg par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur.
- Ramenez les souris dans leur cage et placez une carte « Agent BSL-2 en utilisation » sur la cage.
- Surveillez les souris pour détecter la détresse respiratoire immédiatement après l’intubation, puis toutes les 15 minutes jusqu’à ce que les souris se réveillent de l’anesthésie. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Examinez les souris 24 heures après l’intubation et trois fois par semaine pour détecter tout signe de morbidité.
- Consigner dans le journal de bord la date de l’intervention, l’identification de l’animal, le type d’intervention, le type d’anesthésie et les observations et heures de surveillance postopératoire.
- Surveiller les souris pour détecter une perte de poids, une détresse respiratoire, des anomalies comportementales et un score d’état corporel <2 (segmentation de la colonne vertébrale évidente/les os pelviens dorsaux sont palpables) toutes les deux semaines après l’inoculation de bleomycin.
note: Les souris atteintes de tumeurs pulmonaires peuvent présenter une irritation respiratoire, une perte de poids, une cachexie et/ou la mort.
- Euthanasier les souris en détresse respiratoire ou les souris qui ont subi une perte de masse corporelle de 15 % par le dioxyde de carbone ou par la kétamine/xylazine suivie d’une luxation cervicale si vous collectez des tissus. Confirmer l’euthanasie en effectuant une palpation pour l’activité respiratoire.
3. Surveillance de la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence
- Répétez l’imagerie des souris au jour 3 après la greffe et toutes les semaines par la suite.
- Anesthésier les souris en injectant de la kétamine/xylazine (comme décrit aux étapes 2.4-2.5) ou de l’isoflurane inhalé (2 %). Surveillez la respiration des souris et utilisez un pincement des orteils pour confirmer une anesthésie correcte. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Rasez toute la région des côtes ventralement et dorsalement de B6129SF1/J et d’autres souches de souris aux poils foncés à l’aide d’un rasoir électrique avant l’imagerie.
- Une fois que les souris sont sous anesthésie, injectez 100 μL de luciférine par voie rétro-orbitaire (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille à insuline. Attendre 2 min. Alterner l’œil utilisé pour l’injection à chaque séance d’imagerie.
- Placez les souris dans l’imageur et acquérez des images dorsales et ventrales comme décrit aux étapes 2.22 à 2.24.
- Remettez les souris dans la cage après l’imagerie, sur le dos sur une surface plane pour les récupérer.
note: L’ensemble de la procédure prendra 5 minutes par groupe de 5 souris. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Analysez les images à l’aide du logiciel d’analyse imageur/bioluminescence.
