Dosage de l’immunofluorescence CTC : une technique pour caractériser les cellules tumorales circulantes

Résumé

Source : Garcia, J., et al. Caractérisation et dénombrement semi-automatiques de-L1 de cellules tumorales circulantes de patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules par immunofluorescence.J. Vis. Exp.(2019)

Cette vidéo décrit le test d’immunofluorescence des cellules tumorales circulantes (CTC), une technique permettant de caractériser les biomarqueurs sur les cellules tumorales circulantes dans des échantillons de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules. Ce test pourrait être utilisé pour surveiller les changements dynamiques de la tumeur et de la réponse immunitaire, qui peuvent refléter la réponse à la chimiothérapie, à la radiothérapie et à d’éventuels traitements d’immunothérapie.

Protocole

1. Coloration par immunofluorescence

1. Énumérer sur une lame chambrée avec une grille de type hémocytomètre le nombre de cellules par ml. Diluer l’échantillon enrichi avec une solution anti-liaison à 0,2 % (tableau des matériaux) jusqu’à une concentration atteignant 100 000 cellules/100 μL par cytospin.
2. Humidifiez le contour de la chambre d’échantillonnage à l’aide de coton (tableau des matériaux) avec 50 μL de solution anti-liant à 0,2 %. Placez une lame de verre en polylysine dans la chambre d’échantillonnage et fermez-la.
3. Enduisez une pointe d’une solution anti-liant à 0,2 % en pipetant 3 fois de haut en bas. Remettez l’échantillon enrichi en suspension et transférez la solution cellulaire dans la chambre d’échantillonnage. Centrifugeuse avec une centrifugeuse dédiée (Table des Matériaux) à 400 tr/min pendant 4 min (accélération faible).
4. Placez un isolateur en silicium autour de la zone de dépôt. Laissez sécher la lame de verre sous une enceinte de sécurité microbiologique pendant 2 min.
5. Préparez la solution de fixation en diluant 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 16 % avec 3 mL de PBS stérile. Ajouter 100 μL de solution de fixation (4 % de PFA) par échantillon et incuber à RT pendant 10 min. Retirer la solution de fixation et effectuer trois lavages avec 200 μL de PBS et incuber à RT chacun pendant 2 min
   ATTENTION : Utilisez le PFA sous une enceinte de sécurité chimique pour éviter l’inhalation.
6. Préparez la solution de saturation en diluant le sérum de veau fœtal (FBS) à 5 %, le réactif bloquant le récepteur Fc (FcR) à 5 % et l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans du PBS stérile (Table des matériaux). Ajouter 100 μL de solution de saturation par échantillon et incuber pendant 30 min à RT. Retirer la solution de saturation.
7. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps par échantillon (anticorps CD45 1/20 ; Anticorps PanCK 1/500 ; Anticorps-L1 1/200 ; Qsp solution de saturation 100 μL) (Tableau des matériaux). Placez la lame de verre polylysine dans une boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm. Humidifiez un papier absorbant avec 2 mL d’eau stérile et fermez la boîte de Pétri avec le couvercle. Placer à 4 °C pendant la nuit et à l’abri de la lumière.
8. Retirez le mélange d’anticorps et effectuez 3 lavages avec 200 μL de PBS en incubant chaque lavage pendant 2 min. Laissez sécher l’échantillon pendant 5 minutes et protégez-le de la lumière. Placez 10 μL de solution de montage (table des matériaux) dans la zone de dépôt et recouvrez avec une lamelle de microscope sans faire de bulle. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
F-68 Pluronic 10 %	Gibco	Référence 24040-032	Solution anti-liaison. Conditions de conservation : Température ambiante
Cytoentonnoirs EZ	ThermoFisher	A78710003	Chambre d’échantillonnage avec coton. Conditions de conservation : Température ambiante
Centrifugeuse Shandon Cytopsin4	ThermoFisher	A78300003	Centrifugeuse dédiée. Conditions de conservation : Température ambiante
Paraformaldéhyde 16 %	ThermoFisher	11490570	Solution de fixation. Conditions de stockage : +4°C
Saline tamponnée au phosphate Ultra Pure Grade 1X – 1L	Laboratoire de la 1ère Base	BUF-2040-1X1L	Conditions de conservation : Température ambiante
Agent de blocage FcR	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-059-901	Conditions de stockage : +4°C
Anticorps monoclonal-L1 (clone 29E2A3) - Phycoérythrine	BioLégende	BLE329706	Conditions de stockage : +4°C
Anticorps monoclonal PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	Référence 53-9003-80	Conditions de stockage : +4°C
Anticorps monoclonal CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLégende	BLE304020	Conditions de stockage : +4°C
Monture Fluoro	sigma	Réf. F4680	Solution de montage. Conditions de conservation : Température ambiante
Pétri	Dutscher	Référence 632180	Conditions de conservation : Température ambiante
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Conditions de stockage : +4°C
Lames en polylysine	ThermoFisher	J2800AMNZ	Conditions de conservation : Température ambiante
Isolateur en silicium	Grace bio-Labs	Référence 664270	Conditions de conservation : Température ambiante
Eau déminéralisée stérile – 100 mL	Laboratoire de la 1ère Base	CUS-4100-100ml	Conditions de conservation : Température ambiante
Sérum de veau fœtal (FCS)	Gibco	Référence 10270-106	Conditions de stockage : +4°C