Escalade de dose : une méthode pour développer une résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses

Résumé

Source : Yamaoka T. et al., Établissement et caractérisation de trois lignées cellulaires d’adénocarcinome pulmonaire PC-9 résistant à l’afatinib développées avec des doses croissantes d’afatinib. J. Vis. Exp., 2019

La vidéo décrit le développement de la résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses en exposant les cellules à des doses croissantes d’un médicament après avoir calculé les valeurs IC₅₀ du médicament au préalable avec le test MTT. L’exemple de protocole décrit le processus étape par étape de développement de cellules résistantes aux médicaments.

Protocole

1. Etablissement de trois lignées cellulaires PC-9 indépendantes résistantes à l’afatinib

1. Détermination de la concentration initiale d’exposition à l’afatinib pour les cellules PC-9 à l’aide de l’essai au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).
   1. Cultiver des cellules PC-9 dans un milieu de croissance contenant du sérum de veau fœtal (10 %), de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (100 μg/mL) dans une boîte de 10 cm traitée en culture cellulaire dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   2. Remettre en suspension les cellules PC-9 à raison de 4 x 10^cellules 4/mL dans un milieu de croissance, puis ensemencer à 50 μL/puits dans une microplaque à 96 puits. La concentration finale de cellules est de 2,0 x 10³ cellules/50 μL/puits. Incuber une nuit dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37°C.
   3. Ajouter 50 μL de solution d’afatinib à différentes concentrations : 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 et 20 μM dans les puits contenant le milieu de croissance (50 μL). Le volume final et les concentrations d’afatinib sont de 100 μL et de 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 et 10 μM, respectivement.
   4. Incuber la plaque à 96 puits pendant 96 h dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   5. Ajouter 15 μL de solution de colorant (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber pendant 4 h dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C, puis ajouter 100 μL de solution de solubilisation/arrêt (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber toute la nuit dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   6. Mesurez la densité optique à 570 nm (OD₅₇₀) à l’aide d’un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux). Préparez 6 à 12 répétitions et répétez les expériences au moins trois fois.
   7. À l’aide d’un logiciel statistique (voir la Table des matières) pour tracer graphiquement ces données sous la forme d’un graphique semi-logarithmique et calculer la valeur de la CI₅₀, qui est la concentration du médicament qui réduit la réponse à 50 % de son maximum (voir la Table des matières).
2. Exposition continue des cellules PC-9 à l’inégalitaire irréversible EGFR, l’afatinib, par augmentation progressive de la dose dans trois boîtes indépendantes de 10 cm
   1. Cultiver des cellules PC-9 dans des boîtes p100 contenant 10 mL de milieu de culture. Lorsque les cellules PC-9 atteignent le stade subconfluent, transférez 1 mL de suspension cellulaire dans trois nouvelles boîtes p100, avec 9 mL de milieu de croissance. Les cellules PC-9 diluées à l’échelle 1:10 deviennent sous-confluentes en 3 à 4 jours, avec un nombre de cellules d’environ 4-5 x 10⁵ cellules/mL.
   2. Le lendemain, ajoutez 1/10 de la valeur IC₅₀ de l’afatinib dans chacune des trois paraboles p100.
      REMARQUE : L’afatinib est reconstitué dans le DMSO à des concentrations de matière première de 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM et 5 mM. 1 à 10 μL de solution d’afatinib sont ajoutés à 10 mL de milieu de croissance dans la culture, selon les concentrations finales requises.
   3. Lorsque les cellules des boîtes p100 contenant de l’afatinib deviennent sous-confluentes, bien mélanger par aspiration avec une pipette de 1 mL et ajouter 1 mL de suspension cellulaire à 9 mL de milieu de croissance frais dans une nouvelle boîte p100. Ensuite, ajoutez des concentrations plus élevées de 10 à 20 % d’afatinib à la nouvelle culture.
   4. Augmenter la concentration d’afatinib de 0,1 nM à 1 μM dans le milieu par l’augmentation progressive de la dose, la concentration d’afatinib augmentant de 10 à 20 % à chaque étape sur une période de 10 à 12 mois.
      note: Lorsque la concentration d’afatinib approche la valeur CI₅₀, la croissance cellulaire devient assez lente. Si les cellules sont divisées 1:9, elles peuvent ne pas se développer, car ces cellules sont tuées par des concentrations plus élevées d’afatinib. Par conséquent, à des concentrations plus élevées d’afanitib, les cellules peuvent être divisées dans un rapport de 1:2. Les cellules les plus résistantes ont été cultivées dans un milieu contenant de l’afatinib pendant 3 à 14 jours, et le milieu n’a pas été modifié jusqu’à ce que les cellules résistantes aient besoin d’être éliminées.
   5. Cultivez les cellules résistantes à l’afatinib pendant 2 à 3 mois dans un milieu de croissance contenant 1 μM d’afatinib. À une concentration d’afatinib de 1 μM, il faut de 10 à 12 mois pour développer une résistance à l’afatinib dans ce modèle. Effectuez le test MTT pour confirmer que les cellules sont résistantes à l’afatinib. Les trois lignées cellulaires de résistance à l’afatinib établies indépendamment ont été nommées AFR1, AFR2 et AFR3.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FBS	gibco	Référence 26140-079
Streptocoque de stylo	gibco	Référence 15140 à 163
Boîte de 10 cm traitée pour culture cellulaire	Violamo	Référence 2-8590-03
l’afatinib	Selleck	S1011
Microplaque à 96 puits	thermo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	Essai de prolifération cellulaire non radioactive ; Solution colorante et solution de solubilisation/arrêt
Spectrophotomètre NanoDrop Lite	thermo	Na	spectrophotomètre
Logiciel GraphPad Prism v.7	GraphPad, Inc.	Na	un logiciel statistique
Dmso	Wako	Référence 043-07216