Essai de formation de colonies : évaluation de l’efficacité des agents anticancéreux sur les cellules cancéreuses du poumon formant des colonies

Résumé

Source : Lee, J. Y.et al, Évaluation préclinique de la bioactivité de la coumarine anticancéreuse OT48 par des sphéroïdes, des tests de formation de colonies et des xénogreffes de poisson-zèbre.J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit le test de formation de colonies, qui aide à déterminer la capacité des cellules cancéreuses du poumon à proliférer indéfiniment et à former des colonies individuelles. Nous pouvons analyser l’effet d’un agent anticancéreux sur les cellules formant des colonies en analysant les changements dans le nombre et/ou la taille des colonies résultantes.

Protocole

1. Essais de formation de colonies

1. Cultiver des cellules A549 à une concentration de 20 000 cellules/^cm2 dans 15 mL de milieu de culture cellulaire RPMI1640 complété par 10 % de FBS (sérum de veau fœtal) et 1 % d’antibiotiques dans un ballon de 75 cm² dans un incubateur de CO₂ à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Le jour de l’expérience, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Prélever 50 000 cellules par centrifugation à 400 x g pendant 7 min dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et remettre en suspension les cellules dans 100 μL de 1 PBS (Phosphate Buffered Saline) stérile dans des tubes de 1,5 mL.
3. Distribuer 1,1 mL de milieu semi-solide à base de méthylcellulose (MCBM) dans des tubes de 15 mL à l’aide d’une multipipette. Préparez un tube pour chaque condition.
4. Ajouter 110 μL de FBS à 1,1 mL de MCBM à l’aide d’une micropipette P200.
5. Ensemence les cellules à 1 000 cellules/mL. Prélever 2,4 μL de suspension cellulaire dans la solution mère (50 000 cellules dans 100 μL de 1x PBS) à l’aide d’une micropipette P2 et ajouter à 1,1 mL de MCBM complété par 10 % de FBS.
6. Après avoir ajouté les cellules, faites tourbillonner les tubes pendant 1 min, en les tenant verticalement à la vitesse la plus élevée pour bien mélanger le MCBM et les cellules.
7. Ajouter des composés d’essai (OT48 seul ou en combinaison avec A1210477). Préparez un tube séparé comme contrôle pour le solvant utilisé (ici le diméthylsulfoxyde (DMSO)). Selon la concentration des composés et le volume ajouté pour chaque condition, le témoin du solvant comprendra la concentration la plus élevée de solvant utilisée pour les dilutions du composé d’essai, afin d’évaluer les effets nocifs causés par le solvant.
8. Tubes vortex pendant 1 minute.
9. Pour chaque dosage, ajoutez 1 mL du mélange à l’aide d’une micropipette P1000 dans le puits central d’une plaque de culture cellulaire à 12 puits.
10. Remplissez les puits vides avec 1 ml d’eau stérile ou 1 PBS pour stabiliser l’humidité.
11. Incuber des plaques de culture pendant 10 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂
12. Après 10 jours d’incubation, ajouter 200 μL d’une solution mère de bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT) (5 mg/mL) dans chaque puits pour atteindre une concentration finale de 1 mg/mL.
13. Incuber 10 min dans un incubateur à 37 °C et 5 % CO₂. Les colonies viables deviendront violettes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A549	ATCC	CCL-185	37 °C°
RPMI 1640	Lonza	Référence 30096	4 °C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Pénicilline-streptomycine	Lonza	17-602E	-20 C°
Fiole de culture cellulaire T75	Spl	Référence 70075	Rt
La solution PBS	Hyclone	SH30256.02	Rt
Tube de 1,5 ml	Extragène	Tube-170-C	Rt
Tube de 15 ml	Hyundai Micro	N° H20015	Rt
Plaque à 12 puits	Spl	Référence 30012	Rt
MéthoCulte	Technologies StemCell	4230	-20 C°
Bromure de tétrazolium bleu de thiazolyle (poudre de MTT)	sigma	Référence M5622	4 °C°
LAS4000	GE Technologies de la santé		Rt