Dosage de la xénogreffe de poisson-zèbre : une méthode pour évaluer l’efficacité anticancéreuse des produits thérapeutiques sur la tumorigénicité chez le poisson-zèbre in vivo

Résumé

Source : Lee, J. Y et al.,Évaluation préclinique de la bioactivité de la coumarine anticancéreuse OT48 par des sphéroïdes, des tests de formation de colonies et des xénogreffes de poisson-zèbre.J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit le test de xénogreffe de poisson-zèbre pour évaluer la formation de tumeurs in vivo et étudier l’effet des agents thérapeutiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Essai de xénogreffe de poisson-zèbre

REMARQUE : Cette approche technique est visualisée sous forme de schéma (Figure 1).

1. Préparation des réactifs de base
   1. Préparez 1 L de solution 30x Danieau : 1740 mM de NaCl, 21 mM de KCl, 12 mM de MgSO₄•7H2O, 18 mM de Ca(NO₃)₂ et 150 mM d’HEPES. Ajustez le pH du tampon à 7,6 à l’aide d’un pH-mètre.
   2. Préparer une solution de tricaïne à 1 % (50x) : Dissoudre 20 mg de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne) dans 2 mL d’eau distillée.
   3. Préparez une solution de rouge de phénol à 1 % : Ajoutez 2 μL de solution de sel de sodium de Phenol Red à 198 μL de solution de PBS stérilisée dans un tube de 1,5 μL.
   4. Préparez 3 % de méthylcellulose : Ajouter 3 g de méthylcellulose à 100 ml de 1 solution de Danieau.
2. Production et incubation d’œufs de poisson-zèbre
   1. Séparez une femelle et un poisson-zèbre mâle dans un réservoir rempli d’eau du robinet stérilisée aux UV et filtrée à 28,5 °C dans l’obscurité. Après 24 h de séparation, mélangez les poissons des deux sexes pour commencer l’accouplement. Transférez les œufs fécondés de la cuve d’accouplement dans une boîte de Pétri contenant 5 ml de solution fraîche de Danieau.
   2. Lavez les œufs trois fois avec 5 ml de la solution Danieau. Pour le lavage, aspirez soigneusement les œufs à l’aide d’une pipette et transférez-les dans 5 mL de solution fraîche. Incuber pendant 8 h à 28,5 °C.
      1. Après 8 h d'incubation dans la solution de Danieau, passer à la solution de Danieau contenant 0,03 % de 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour inhiber la pigmentation. Triez les œufs opaques (non fécondés ou contenant des embryons non développés) pour éviter la contamination.
3. Déchorionisation embryonnaire
   1. 24 h après la fécondation (HPF), déchoratifs des embryons de poisson-zèbre à l’aide de pinces tranchantes. Incuber les embryons en éclosion dans la solution de Danieau avec 0,03 % de PTU à 28,5 °C jusqu’à 48 hpf.
4. Préparation cellulaire traitée avec composé
   1. Semez les cellules A549 à 20 000 cellules/^cm2 dans des flacons de^{culture de 25} cm. Après 24 h de semis, ajouter des composés (ici OT48 à 50 μM et/ou A1210477 à 20 μM) pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Fixez le temps de traitement de chaque composé pour maintenir la viabilité des cellules mais pour les engager vers la mort cellulaire. Ce point temporel doit être défini individuellement en fonction de la viabilité cellulaire, de la morphologie et des marqueurs moléculaires.
   3. 2 h avant la fin du traitement, colorer les cellules avec 4 μM de colorant fluorescent CM-Dil à 37 °C et 5 % de CO₂. Après 2 h d’incubation, trypsiniser les cellules avec 0,05 % de trypsine-EDTA et diluer 106 cellules dans 50 μL de solution de phénol Red-PBS avant l’injection.
5. Micro-injection de cellules cancéreuses pour la formation de xénogreffes
   1. Anesthésie le poisson-zèbre dans une solution de tricaïne à 0,02 % pendant 5 minutes jusqu’à ce qu’il se dépose sur une plaque de gélose.
   2. Tirez un capillaire en verre de 1,0 mm (diamètre extérieur (OD)) à l’aide d’un extracteur de micropipette (Paramètres du programme : P : 300, Chaleur : 260, Traction : 60, VEL : 50 et Temps : 200). Coupez le microcapillaire avec une seringue pour produire un bord tranchant. Chargez les microcapillaires avec 20 μL de solution de cellule/phénol Red-PBS. Réglez la pression d’injection et le temps de distribution de 2 nL par injection.
   3. Injectez 100 à 200 cellules dans le sac vitellin en injectant 6 à 10 nL via 3 à 5 injections. Après l’injection, laisser le poisson récupérer pendant 10 à 30 minutes dans 5 mL de solution fraîche de Danieau contenant de la solution de PTU. Répartir le poisson dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de la solution de Danieau contenant de la solution de PTU et l'incuber pendant 72 h à 28,5 °C.
   4. Après 72 h d’incubation, anesthésier le poisson dans une solution de tricaïne à 0,02 % et l’immobiliser sur une lame de verre avec une goutte de méthylcellulose à 3 %. Prenez 5x photos par microscopie à fluorescence à une longueur d’onde de 620 à 750 nm.
   5. Quantifiez la taille des tumeurs fluorescentes à l’aide du logiciel ImageJ. Sélectionnez le menu "Analyser | Mesurer". Enregistrez les valeurs correspondant au signal fluorescent et analysez-les avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique.

Résultats

Figure 1 : Schéma de principe du processus global du test de xénogreffe de poisson-zèbre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A549	ATCC	CCL-185	37 °C°
RPMI 1640	Lonza	Référence 30096	4 °C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Pénicilline-streptomycine	Lonza	17-602E	-20 C°
Fiole de culture cellulaire T25	Spl	Référence 70025	Rt
Fiole de culture cellulaire T75	Spl	Référence 70075	Rt
Fiole de culture cellulaire T175	Spl	Référence 71175	Rt
Tube de 1,5 ml	Extragène	Tube-170-C	Rt
Plaque à 24 puits	Spl	Référence 30024	Rt
Pétridure	Spl	Référence 10100	Rt
La solution PBS	Hyclone	SH30256.02	Rt
Trypsine-EDTA	Gibco	Tél. : 25-300-054	4 °C°
chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	Référence 71382	Rt
Chlorure de potassium (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	Rt
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	Rt
Nitrate de calcium tétrahydraté (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	Réf. C1396	Rt
La solution HEPES	Sigma-Aldrich	N° H0887	Rt
Méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (Tricaïne)	Sigma-Aldrich	E10521	Rt
Solution de rouge de phénol	Sigma-Aldrich	Réf. P0290	Rt
Méthylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	Rt
1-phényl-2-thiourée (PTU)	Sigma-Aldrich	Réf. P7629	Rt
Colorant CM-Dil	Invitrogen	Réf. C7001	-20 C°
Capillaire en verre	Instruments de précision mondiaux	TW 100F-4	Rt
Extracteur de micropipette	Instrument d’obturateur, États-Unis	P-97	Rt
Micro-injecteur	Instruments de précision mondiaux	PV820	Rt
seringue	KOVAX	1ml	Rt
Micro chargeur	Eppendorf	5242956003	Rt
Toboggan en verre	Marienfeld	Réf. HSU-1000612	Rt
Microscopie à fluorescence	Leica	DE/DM 5000B	Rt