1. Synthèse de l’Acide Hyaluronique-Céramide (HACE)
- Solubiliser 12,21 mmol d’oligomère d’acide hyaluronique (HA) et 9,77 mmol d’hydroxyde de tétra-n-butylammonium (TBA) dans 60 ml d’eau bidistillée (DDW). Remuer pendant 30 min.
- Pour synthétiser l’agent de liaison DS-Y30, dissolvez 8,59 mmol de céramide DS-Y30 et 9,45 mmol de triéthylamine dans 25 ml de tétrahydrofurane (THF). Mélanger avec 8,59 mmol de chlorure de 4-chlorométhylbenzoyle dans du THF. Remuez pendant 6 h à 60 °C.
- Dissoudre les 8,10 mmol synthétisés de HA-TBA et 0,41 mmol de l’agent de liaison DS-Y30 dans un mélange de THF et d’acétonitrile (4:1, v/v). Remuez pendant 5 h à 40 °C.
- Éliminez les impuretés en filtrant avec un agent filtrant et éliminez le solvant organique par évaporation sous vide. Purifier le produit à l’aide d’une membrane de dialyse (poids moléculaire coupé : 3,5 kDa) et lyophiliser.
2. Préparation des nanoparticules
- Dissoudre 1 mg de HB et 1 mg de paclitaxel dans 0,5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) et mélanger avec 0,5 ml de DDW par mélange vortex pendant 5 min. Ensuite, solubiliser l’OCHA dans ce mélange par mélange vortex pendant 5 minutes supplémentaires.
- Pour éliminer le solvant, chauffer à 70 °C pendant 4 heures sous un léger jet d’azote gazeux.
- Remettre en suspension le film composé d’HACE, HB et de paclitaxel avec 1 ml de DDW. Filtrez à l’aide d’un filtre à seringue (pores de 0,45 μm) pour éliminer les médicaments non encapsulés.
3. Phototoxicité in vitro
- Absorption de nanoparticules dans les lignées cellulaires du cancer du poumon
- Préparez le milieu RPMI-1640 contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et 1 % (p/v) de pénicilline-streptomycine.
- Ensemencer les cellules A549 dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits à une densité de 1 × 105 cellules/puits (triplés pour chaque groupe). Incuber pendant 24 heures à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 et à 95 % d’air.
- Après la fixation des cellules, retirez le milieu et lavez les cellules en ajoutant 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Dissoudre les nanoparticules dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 2 μM/ml HB. Ensuite, incubez les cellules avec 1 ml de PBS, de NP vides, de HB-NP ou de HB-P-NP dans chaque puits pendant 4 heures dans l’obscurité.
- Retirez toute la solution et lavez les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répétez l’étape de lavage une fois de plus. Ajouter un milieu de culture frais.
- Essai de viabilité cellulaire
- Placez la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec une distance de 1 cm entre la fibre PDT et le puits). Portez des lunettes de sécurité laser et éclairez les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW/cm2) dans l’obscurité pendant différentes périodes de temps : 0, 5, 10, 20, 30 et 40 secondes (0, 2, 4, 8, 12 et 16 J/cm2). Ensuite, incubez les cellules pendant 24 heures dans l’obscurité.
- Aspirez le milieu et lavez les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répétez l’étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter 10 μl de solution de mesure de la cytotoxicité dans chaque puits. Incuber dans l’obscurité pendant 2 heures.
- Mesurez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
