$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Synthèse de l’Acide Hyaluronique-Céramide (HACE)
- Solubiliser 12,21 mmol d’oligomère d’acide hyaluronique (HA) et 9,77 mmol d’hydroxyde de tétra-n-butylammonium (TBA) dans 60 ml d’eau bidistillée (DDW). Remuer pendant 30 min.
- Pour synthétiser l’agent de liaison DS-Y30, dissolvez 8,59 mmol de céramide DS-Y30 et 9,45 mmol de triéthylamine dans 25 ml de tétrahydrofurane (THF). Mélanger avec 8,59 mmol de chlorure de 4-chlorométhylbenzoyle dans du THF. Remuez pendant 6 h à 60 °C.
- Dissoudre les 8,10 mmol synthétisés de HA-TBA et 0,41 mmol de l’agent de liaison DS-Y30 dans un mélange de THF et d’acétonitrile (4:1, v/v). Remuez pendant 5 h à 40 °C.
- Éliminez les impuretés en filtrant avec un agent filtrant et éliminez le solvant organique par évaporation sous vide. Purifier le produit à l’aide d’une membrane de dialyse (poids moléculaire coupé : 3,5 kDa) et lyophiliser.
2. Préparation des nanoparticules
- Dissoudre 1 mg de HB et 1 mg de paclitaxel dans 0,5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) et mélanger avec 0,5 ml de DDW par mélange vortex pendant 5 min. Ensuite, solubiliser l’OCHA dans ce mélange par mélange vortex pendant 5 minutes supplémentaires.
- Pour éliminer le solvant, chauffer à 70 °C pendant 4 heures sous un léger jet d’azote gazeux.
- Remettre en suspension le film composé d’HACE, HB et de paclitaxel avec 1 ml de DDW. Filtrez à l’aide d’un filtre à seringue (pores de 0,45 μm) pour éliminer les médicaments non encapsulés.
3. Efficacité anticancéreuse in vivo chez les souris porteuses de tumeurs
- Modèle murin induit par le cancer du poumon
- Préparez 1 × 106 cellules A549 dans 0,1 ml de milieu RPMI-1640 et conservez-le dans de la glace.
- Anesthésier les souris avec une injection intraveineuse d’une xylazine et d’un mélange de tilétamine et de zolazépam (1:2, 1 ml/kg). Confirmez la bonne anesthésie en pinçant doucement un petit pli de peau de souris. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
note: Si aucun mouvement n’est observé, l’animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
- Injectez les cellules par voie sous-cutanée dans les flancs gauches de souris nues mâles BALB/C (âgées de 6 à 7 semaines, 20 à 22 g).
- Continuez à observer les souris jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer dans la cage.
note: Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli. Gardez les souris dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques (FPS).
- Mesurez la taille de la tumeur avec des pieds à coulisse tous les jours. Calculez le volume tumoral (mm3) comme (longueur × largeur2) / 2. Lorsque la taille de la tumeur atteint environ 200 mm3 de volume, commencez l’expérience.
- Étude d’efficacité anticancéreuse
- Divisez au hasard les souris en 4 groupes (n = 10 pour chaque groupe).
- Anesthésier les souris avec une injection intraveineuse d’une xylazine et d’un mélange de tilétamine et de zolazépam (1:2, 1 ml/kg). Confirmez la bonne anesthésie en pinçant doucement un petit pli de peau de souris. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
note: Si aucun mouvement n’est observé, l’animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
- Dissoudre les nanoparticules dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 2 mg/ml HB. Injecter du PBS, du HB libre, des HB-NPs ou des HB-P-NPs par la veine caudale (2 mg/kg sous forme de HB) deux fois les jours 0 et 7.
- Continuez à observer les souris jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer dans la cage.
note: Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli. Gardez les cages sombres et dans des conditions SPF spécifiques.
- 24 heures après chaque injection, anesthésier les souris avec une injection intraveineuse d’une xylazine et d’un mélange de tilétamine et de zolazépam (1:2, 1 ml/kg). Confirmez la bonne anesthésie en pinçant doucement un petit pli de peau de souris. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
note: Si aucun mouvement n’est observé, l’animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
- Placez le site de la tumeur sous la fibre PDT (avec une distance de 1 cm entre la fibre PDT et la tumeur). Portez des lunettes de sécurité laser, éteignez l’interrupteur et illuminez la tumeur avec un laser PDT (630 nm, 400 mW/cm2) pendant 500 secondes (200 J/cm2) deux fois les jours 1 et 8.
- Continuez à observer les souris jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer dans la cage. Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
- Gardez les cages dans des conditions SPF. Maintenez les cages dans l’obscurité pendant 24 heures après le traitement au laser.
- Surveillez visuellement le volume de la tumeur et les changements au site de la tumeur tous les jours. Mesurez la taille de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse et calculez le volume comme suit (longueur × largeur2) / 2 (mm3). Prenez des photos des sites tumoraux tous les jours pour vérifier s’il y a des altérations de la surface tumorale après la PDT.
- Le 16e jour, sacrifiez cinq souris par groupe par anesthésie terminale à l’aide d’isoflurane.
- Avec des pinces et des ciseaux, coupez la peau externe et exposez les tumeurs. Récoltez-les soigneusement. Fixez-les dans du formol à 10 %, incrustez-les dans de la paraffine et colorez-les avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) pour l’analyse histologique.
- Après 45 jours de surveillance, sacrifiez les souris restantes par anesthésie terminale à l’aide d’isoflurane.