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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Instillation pulmonaire
- Choisissez une canule intraveineuse commerciale d’un pouce de long et de 20 g à utiliser pour l’intubation.
- Modifiez manuellement l’extrémité du cathéter en la pliant pour générer une légère courbure à l’extrémité, comme illustré à la figure 1.
- Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (15 mg/kg) injecté IP, et confirmer l’anesthésie par l’absence de mouvement réflexe. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux immédiatement après l’anesthésie. Immédiatement après l’anesthésie, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux et donnez du carprofène (5-10 mg/kg SQ) pour l’analgésie post-chirurgicale et par instillation.
- Placez la souris en décubitus dorsal sur une plate-forme inclinée. Comme le montre la figure 2, un grand cartable de bureau avec des boucles de suture collées fonctionne parfaitement bien.
- Rasez la partie ventrale du cou et nettoyez et désinfectez la zone du cou avec de l’alcool à 70 %. Avec des gants neufs sans latex et sans poudre, utilisez des instruments chirurgicaux désinfectés avec de l’alcool à 70 %.
- À l’aide de ciseaux tranchants, faites une petite incision chirurgicale dans le cou à environ 12 mm sous l’incisive inférieure.
- À l’aide d’une pince, tirez doucement la peau du cou vers la caudale jusqu’à ce que la paroi ventrale de la trachée soit visible.
- Rétractez doucement la langue et insérez la canule avec l’extrémité pliée inclinée vers la surface ventrale de la souris. Comme au point 1.4, tirez doucement sur la peau du cou et insérez la canule dans la trachée.
note: Avec un peu de pratique, le cathéter sera visible en descendant dans la trachée. S’il va dans l’œsophage, il n’y aura pas d’observation visuelle du mouvement du cathéter. Aucune incision n’est pratiquée dans la trachée.
- Une fois que le cathéter est visible dans la trachée du cou, avancez-le d’environ 5 mm pour qu’il passe de manière fiable les cordes vocales, mais toujours bien au-dessus de la carène.
- Préparez-vous à instiller jusqu’à 50 μl de liquide en injectant à travers le cathéter avec une pointe de pipette de chargement de gel. Placez la pointe dans le moyeu Luer, mais avant d’injecter, observez attentivement le mouvement du liquide dans la pointe en synchronisation avec la respiration de la souris. Injectez ensuite l’instillé.
- Avec une seringue de 1 ml, faites immédiatement un gonflage relativement rapide de 0,6 ml d’air dans les poumons à travers le cathéter pour aider à répartir le liquide profondément dans les poumons. Retirez la canule.
- Retirez la canule.
- Utilisez une petite quantité d’adhésif cyanoacrylate pour fermer la petite plaie chirurgicale conformément aux instructions de la notice d’emballage de VetBond. Placez les souris dans des cages individuelles et surveillez-les visuellement jusqu’à ce qu’elles se réveillent et se comportent normalement sans aucun signe d’inconfort.
2. Mesure du volume pulmonaire fixe
- Mesurez le volume pulmonaire à l’aide du principe d’Archimède, comme illustré à la figure 3. Retirez le poumon fixe du formaldéhyde et disséquez le cœur et tout autre tissu non pulmonaire
.
- Utilisez un dispositif de support métallique simple et fait maison qui est utilisé pour maintenir les poumons complètement sous l’eau.
note: Cet appareil doit être compatible avec la balance utilisée. Un dispositif typique illustré à la figure 4 est fabriqué à partir de pipettes en plastique et de fil mince (20 G). Ce système fonctionne bien avec la balance utilisée dans la vidéo, mais pourrait facilement être adapté à la plupart des balances de laboratoire.
- Placez un bécher avec ≈200 ml d’eau sur la balance et tare avec la cage de support en place dans l’eau. Voir la figure 5. Retirez la cage métallique ; Placez le poumon à la surface de l’eau et appuyez sous l’eau avec la cage.
- Enregistrez le poids sur la balance. Ce nombre reflète le volume d’eau déplacé et constitue donc une mesure directe du volume pulmonaire. Veillez à ce que le poumon ou la suture ou toute partie de la cage métallique ne touche pas les côtés ou le bas du bécher.
- Pour plus de précision, répétez cette mesure. Retirez le poumon de l’eau et séchez-le sur un mouchoir. Tarez à nouveau le bécher avec la cage en place et répétez la mesure du volume pulmonaire. Il faut ensuite calculer la moyenne des deux mesures de volume.
note: Si les poumons sont laissés dans le formol pendant plus d’une semaine environ, l’air dans les poumons sera dissous dans le liquide. Lorsque cela se produit, le poumon s’enfonce, il n’est donc plus nécessaire d’utiliser un appareil comme sur la figure 4 pour maintenir le poumon immergé. Dans ce cas, le volume peut être mesuré simplement en tenant le poumon par l’un des fils de suture jusqu’à ce qu’il soit complètement immergé, comme illustré sur la figure 3.
