3D DNA FISH : une technique pour localiser un gène spécifique sur un chromosome

Dans cet article

Résumé

Source : Gallerani, G. et.al. <a href="https://www.jove.com/v/56936/characterization-tumor-cells-using-medical-wire-for-capturing">Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer les cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur l’immunofluorescence et l’ADN des poissons. (2017).

L’isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) à partir du sang des patients cancéreux sont un type de biopsie liquide non invasive associée à la rechute et à la progression de la maladie. Cette vidéo décrit la technique d’hybridation par fluorescence in situ de l’ADN (DNA FISH) sur des CTC capturés sur un fil médical, pour étudier un gène d’intérêt spécifique.

Protocole

1. 3D DNA-FISH Jour 2

ATTENTION : Une attention particulière doit être accordée à la température élevée des instruments et à l’humidité de la chambre.

Mettre en place le four d’hybridation et le four à chaleur sèche (~ 3 h avant de démarrer le protocole DNA-FISH). Réglez le four d’hybridation à 75 °C, réglez le four à chaleur sèche à 37 °C et refroidissez la solution de SSC 0,4× (pH = 7,0 ± 0,1) à 4 °C
note: L’état du pH des tampons FISH est critique et doit être de 7,0 ± 0,1.
Lavez le fil 3 fois dans une solution SSC 0,4 × glacée.
note: Gardez le fil dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment au fluorochrome pendant les procédures suivantes.
Sécher 10 min dans l’obscurité sous la sorbonne.
Vortex et faites tourner la sonde pendant 5 s.
Déposer 10 μL de la sonde dans les microtubes de verre. Couvrir d’un film de laboratoire.
Faites tourner les microtubes comme suit : enveloppez le microtube dans un absorbant sec, mettez du papier dans un tube de 50 ml et essorez brièvement.
Placez délicatement le fil séché dans le microtube et insérez le bouchon de fil. Joint avec du ciment en caoutchouc.
prudence: Les deux étapes suivantes impliquent des températures élevées. Portez des gants de protection.
Placez le fil dans une chambre sombre et humide dans le four d’hybridation pendant 8 min à 75 °C pour obtenir une dénaturation complète de l’ADN.
Placez la chambre humide dans un four à chaleur sèche à 37 °C pendant la nuit.

>2. 3D DNA-FISH Jour 3

Mettez un pot de coloration de diapositive avec une solution de SSC de 0,4 × dans un bain-marie et réglez à 72 °C.
Vérifiez la température de la solution SSC 0,4× jusqu’à ce qu’elle atteigne 72 ± 1 °C.
Préparez deux béchers en verre, l’un avec une solution de 2× SSC + 0,05 % de Tween (pH = 7,0 ± 0,1) et le second avec de l’eau distillée.
Retirez la chambre humide du four à chaleur sèche, retirez délicatement le ciment en caoutchouc du bouchon de fil à l’aide d’une pince à épiler et retirez le fil.
note: Tirez avec précaution l’extrémité non revêtue du fil à travers l’IN-Stopper, en faisant attention de ne pas endommager la pointe fonctionnalisée.
Trempez le fil dans la solution SSC 0,4× pendant 2 min à 72 °C.
Laver le fil dans une solution SSC 2× + 0,05 % Tween pendant 30 s à RT.
Lavez le fil à l’eau distillée à RT.
Faites sécher le fil sous la hotte pendant 10 min dans l’obscurité.
Préparez une solution mère de DAPI de 1,43 μM dans 2 mL de PBS 1×.
Incuber l’extrémité fonctionnalisée du fil avec une solution de DAPI dans un flacon de 2 mL pendant 1 h dans l’obscurité à RT.
Rincez le fil deux fois dans 1× PBS et séchez-le à l’air.

3. 3D Observation et analyse au microscope

Positionnez le fil dans le support de fil. Insérez soigneusement l’embout fonctionnalisé par le point d’entrée du support spécial, jusqu’à ce que l’embout corresponde au point d’accouplement. Veillez à ne pas endommager l’embout fonctionnalisé (Figure 1a).
Placez le support spécial sur la platine du microscope. Ajustez la mise au point du microscope à l’aide d’un objectif de 20×. Concentrez-vous d’abord grossièrement sur le support spécial, puis ajustez finement sur les cellules qui apparaissent lumineuses dans le canal DAPI.

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Résultats

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Figure 1 : Fil fonctionnalisé, disposition schématique des sondes de rupture ALK, schéma des modèles attendus de réarrangement ALK et support spécial.(a) Les cases rouges mettent en évidence les trois parties principales du fil : l’embout fonctionnalisé, l’obturateur de fil et l’embout non fonctionnalisé. L’embout fonctionnalisé est la partie la plus délicate ...