Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire de jophie
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1. Préparation du matériel de transplantation et de la table d’opération
REMARQUE : Tous les outils chirurgicaux doivent être autoclavés, et la table et les instruments chirurgicaux doivent être désinfectés avec de l’alcool à 70 %.
- Connectez un support de tête stéréotaxique à l’anesthésie à l’aide d’un masque nasal et allumez le coussin chauffant.
- Connectez une seringue Hamilton étanche au gaz à un tube en polyéthylène et à une canule oculaire à extrémité émoussée.
note: Il est recommandé de remplir toutes les pièces avec du PBS avant l’assemblage. Vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air emprisonnées et retirez-les si présentes.
- Fixez fermement la seringue Hamilton à la table (Figure 1a) ou à une base mobile (Figure 1e) et fixez le tube au stéréomicroscope, avec la canule pendante (c.-à-d. en position d’attente).
note: Utilisez du ruban chirurgical, car il est facile à retirer et à rattacher.
- Préparez une seringue de 1 mL reliée à une aiguille de 30 G remplie d’une solution de buprénorphine à 0,1 mg/kg.
- Préparez une seringue avec du PBS stérile. Vous pouvez également utiliser une pipette.
- Mettez de côté une cage de réveil propre avec une lampe chauffante.
2. Anesthésie et positionnement des souris receveuses pour la chirurgie
REMARQUE : Tous les animaux ont été élevés et maintenus dans un environnement exempt d’agents pathogènes dans les animaleries de l’Université de Lund.
- Anesthésie la souris dans une chambre remplie de 40 % d’isoflurane O2/60 % N2/3 % et transfère la souris anesthésiée sur la plate-forme du support de tête sur un coussin chauffant chaud (Figure 1a). Vérifiez l’absence de réflexes de pédale.
note: L’anesthésie à l’isoflurane est la méthode d’anesthésie préférée pour une récupération rapide après la chirurgie. La salle de microscope doit être correctement ventilée pour utiliser l’isoflurane.
- Placez le museau de la souris dans le masque d’anesthésie connecté à l’appareil d’anesthésie 40 % O2 /60 % N2 0,9 % à 1,5 % isoflurane. Utilisez le pouce et l’index pour soulever légèrement la tête et fixez-la à l’aide des pièces métalliques sur les côtés. Assurez-vous que les oreillettes fixent la tête directement sous les oreilles. Injecter 0,1 mg/kg de solution de buprénorphine par voie sous-cutanée sur le dos de la souris.
note: La buprénorphine est utilisée comme analgésique.
- Inclinez la tête de manière à ce que l’œil à opérer soit tourné vers le haut et proche du chercheur.
- Rétractez doucement les paupières de l’œil à transplanter à l’aide d’une pince émoussée, sortez l’œil et fixez-le sans serrer avec une pince à épiler. Assurez-vous que les pointes de la pince à épiler sont recouvertes d’un tube en polyéthylène fixé à la plate-forme du porte-tête (Figure 1a, encadré).
- Gardez toujours les deux yeux mouillés en appliquant une gouttelette de PBS stérile sur l’œil.
- Transférez les îlots humains du tube scellé de 1,5 mL (section 1) dans une boîte de Pétri avec du PBS stérile et assurez-vous que les îlots sont proches les uns des autres afin de minimiser la quantité de milieu de culture cellulaire transférée (figure 1c).
- Prélever ~20 à 30 îlots dans la canule oculaire reliés à la seringue Hamilton par un tube en polyéthylène.
note: Prenez le moins de liquide possible avec les îlots.
- Suspendez le tube à l’envers et fixez-le au stéréomicroscope (Figure 1d). Collez soigneusement le tube pour laisser les îlots s’enfoncer à l’extrémité du tube vers la canule.
3. Procédure de transplantation
NOTE : Cette méthode a déjà été décrite pour la transplantation d’îlots de souris. Une procédure légèrement modifiée est présentée ici.
- Pincez les coussinets sur les pattes arrière pour vous assurer que la souris est endormie.
- Serrez la pince qui retient l’œil sans perturber la circulation sanguine et appliquez une gouttelette de PBS stérile sur l’œil.
- À l’aide d’une aiguille de 25 G comme scalpel, biseautez vers le haut, ne pénétrez soigneusement que la moitié de la pointe dans la cornée et faites une seule incision latérale. Faites le trou dans un angle vers le haut ; le trou se refermera plus facilement après la greffe (Figure 1f).
- Soulevez délicatement la cornée avec la canule préchargée d’îlots et appliquez lentement des îlots dans l’œil. Évitez d’insérer la canule dans la chambre antérieure pour éviter d’endommager l’iris, mais poussez plutôt prudemment contre l’ouverture cornéenne (Figure 1g). Rétractez lentement la canule de l’ACE.
note: Visez un volume d’injection de 3 à 8 μL. Si le volume est trop important, il exposera l’œil à une pression intraoculaire inutilement élevée et peut entraîner un reflux des îlots injectés hors de la chambre antérieure.
- Lorsque vous rencontrez des difficultés lors de l’insertion des îlots en raison d’une pression accrue dans la chambre oculaire, élargissez le site d’incision en renforçant le site d’incision latéral et réappliquez les îlots.
note: Parfois, les bulles d’air introduites peuvent être utilisées comme supports d’espace.
- Appliquez du gel pour les yeux sur l’œil, desserrez la pince de retenue des yeux et laissez la souris sur l’isoflurane dans la même position pendant 8 à 10 minutes pour laisser les îlots se fixer.
- Retirez la pince qui maintient la paupière et remettez la paupière dans sa position normale.
- Retirez la souris du support de tête et transférez-la dans une cage de réveil.
- Lorsque la souris est éveillée et en mouvement, transférez-la dans la cage d’origine et conservez-la dans le logement de l’animal jusqu’au balayage (au moins 5 jours sont recommandés).
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