Électroporation organoïde : une méthode pour transfecter l’ADN plasmidique dans des organoïdes gastro-intestinaux

Résumé

Source : Gaebler, A. M., et al.Protocole d’électroporation universel et efficace pour le génie génétique des organoïdes gastro-intestinaux. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo décrit le protocole d’électroporation pour la transfection de grands plasmides en organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels afin de prouver sa fonctionnalité universelle dans différentes entités, à savoir l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), le cancer colorectal (CRC), le cholangiocarcinome (CCC) et les organoïdes du cancer gastrique (GC).

Protocole

1. Culture et préparations d’organoïdes avant électroporation

1. Établissez des organoïdes par digestion tissulaire comme décrit précédemment et développez-les avec leur milieu de culture spécifique à l’entité correspondante dans une matrice de base, voir le Tableau 1 et le Tableau des matériaux
   note: Pour les échantillons de tissus humains, le consentement éclairé et l’approbation de l’étude par un comité d’éthique sont nécessaires.
2. Préchauffer les plaques de 48 puits à 37 °C pour l’ensemencement post-électroporation.
3. Préparer un milieu basal sans antibiotiques ainsi qu’un milieu de culture organoïde spécifique à l’entité sans antibiotiques (voir tableau 1), y compris 10 μM Y-27632 et 3 μM CHIR99021.
   note: Le sevrage des antibiotiques est important pour réduire les effets toxiques. L’Y-27632 et CHIR99021 améliorer la récupération cellulaire.
4. Préparation des organoïdes (voir Figure 1)
   1. Cultivez 5 puits d’organoïdes dans une plaque de 48 puits par échantillon d’électroporation dans le milieu de culture.
      note: Des organoïdes prolifératifs doivent être utilisés (environ 2-3 jours après la dernière fente).
   2. Préparez 230 μL de réactif de dissociation (voir le tableau des matériaux) dont 10 μM d’Y-27632 par puits.
   3. Retirer le milieu de culture de chaque puits et dissocier mécaniquement les organoïdes dans 230 μL du mélange de dissociation préparé. Regroupez 5 puits par échantillon d’électroporation dans un tube de 15 ml.
   4. Mélanger par vortex et incuber pendant 5 à 15 minutes à 37 °C jusqu’à ce que des amas de 10 à 15 cellules se produisent. Par conséquent, vérifiez la dissociation au microscope. Arrêtez la digestion en ajoutant du milieu de base sans antibiotiques jusqu’à 10 mL.
      note: Cette étape est très critique ! L’efficacité de l’électroporation sera réduite, lorsque l’incubation est trop courte, mais une digestion longue réduira la capacité de survie.
   5. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter le surnageant et laver deux fois avec 4 mL de tampon d’électroporation (voir le tableau des matériaux).

2. Électroporation

REMARQUE : Le protocole suivant est développé pour les électroporateurs capables d’ondes carrées et de séquences d’impulsions de pores et de transfert séparées (voir Figure 2). En option, les valeurs d’impédance ainsi que les tensions, les courants et les énergies transférés dans l’échantillon peuvent être mesurés comme contrôle pour des expériences reproductibles.

1. Remettre en suspension la pastille organoïde dans 100 μL de tampon d’électroporation (voir Tableau des matériaux) contenant 30 μg d’ADN plasmidique.
   note: La concentration de l’ADN plasmidique utilisé doit dépasser 5 μg/μL pour une concentration optimale en sel pendant le processus d’électroporation. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser des maxi kits de plasmides endofree (voir Tableau des matériaux) pour la préparation de vecteurs. Une quantité totale allant jusqu’à 45 μg d’ADN peut être utilisée sans effets cytotoxiques.
2. Versez le mélange complet d’ADN-organoïde dans une cuvette d’électroporation d’une largeur d’espace de 2 mm sans produire de bulles d’air.
3. Réglez les paramètres d’électroporation (voir tableau 2, figure 2).
4. Mélangez légèrement les cellules sans mousser en tapotant la cuvette avec un doigt. Placez la cuvette dans la chambre de la cuvette.
5. Appuyez sur le bouton Ω de l’électroporateur et notez la valeur d’impédance.
   note: Une impédance comprise entre 30 et 40 Ω a donné les meilleurs résultats. En général, il devrait se situer entre 30 et 55 Ω. Si ce n’est pas le cas, veuillez contrôler les aspects suivants : la largeur de l’espace de la cuvette utilisée, les connexions des câbles de l’électroporteur, les éventuelles bulles d’air, le volume correct et la concentration en sel du mélange d’électroporation.
6. Appuyez sur le bouton Start pour exécuter le programme d’électroporation et contrôler les valeurs de courants, de tensions et d’énergies affichées.
   note: Les valeurs des tensions, courants et énergies mesurés doivent correspondre aux paramètres d’électroporation définis. Pour la comparaison d’expériences répétées, il peut être utile de noter ces données.
7. Après l’électroporation, ajouter immédiatement 500 μL de milieu de culture sans antibiotiques (avec CHIR99021 et Y-27632 ; voir étape 1.3). Mélanger par pipetage de haut en bas pour dissocier la mousse blanche.
   note: La mousse blanche apparaît après le processus d’électroporation et un nombre important de cellules y est attaché. Ainsi, la dissociation de celui-ci est très importante pour ne pas perdre de cellules.
8. Transvaser l’échantillon complètement de la cuvette dans un nouveau tube de 15 mL à l’aide de la pipette appartenant aux cuvettes d’électroporation (voir Tableau des matériaux). Il est recommandé de rincer à nouveau la cuvette avec un milieu basal pour obtenir les cellules restantes.
9. Pour la régénération des cellules, incubez-les pendant 40 min à température ambiante.

3. Ensemencement des cellules

1. Centrifugez les cellules à 450 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant.
2. Remettez la pastille en suspension dans 100 μL de matrice de socle et ensemencez des gouttes de 20 μL dans une plaque préchauffée à 48 puits (voir l’étape 1.2). Incuber pendant 10 min à 37 °C pour la polymérisation et ajouter 250 μL de milieu de culture, qui est complété par de l’Y-27632 et CHIR99021 jusqu’à la prochaine division des organoïdes cultivés (environ 5 à 7 jours).

4. Détermination de l’efficacité de transfection

REMARQUE : En général, il est recommandé d’électroporater un vecteur porteur d’un marqueur de fluorescence comme contrôle supplémentaire de la transfection. En fonction du marqueur choisi et de la maturation de son chromophore, la fluorescence sera visible dans les 24 à 48 heures suivant la transfection18.

1. Vérifiez la fluorescence au microscope après 24 à 48 h dans le contrôle de transfection (Figure 3B)

Tableau 1 : Composition des milieux de base, des mélanges de digestion et des milieux de culture.

Composants du milieu de base :	Je	Ii
DMEM/F-12 avancé	-	-
Glutamax	1x	1x
Hepes	10 millions d’euros	10 millions d’euros
Pénicilline Streptomycine	-	1x
Primocin	1x	-

Etablissement par digestion
Mélange de digestion :	deux-points		Estomac		Foie		Pancréas
	normal	tumoral	normal	tumoral	normal	tumoral	normal	tumoral
Collagénase II	-	-	-	-	-		0,625 mg/ml
Collagénase XI	-	0,1 mg/ml	-	0,1 mg/ml	-		-
Collagénase D	-	-	-	-	2,5 mg/ml		-
Dispase II	-	1 mg/ml	-	1 mg/ml	-		2,5 mg/ml
DNase I	-	-	-	-	0,1 mg/ml		-
Edta	2 millions d’euros	-	10 millions d’euros	-	-		-
Dilué dans	Tampon chélatant*	Milieu basal I	Tampon chélatant*	Milieu basal I	en EBSS		Milieu basal I
Incubation pour :	0,5 h sur glace	1h à 37°C	0,25-0,5 h à RT	1h à 37°C	0,5-1 h à 37°C	1,5 h à 37°C	0,5-1 à 37°C	2-3 h à 37°C
Adapté de la référence :	Sato et al., 2011		Bartfeld et al. 2015		Broutier et al. 2016		Hennig et al. 2019

Milieu de culture (Basique : Milieu de base II)
N° A83-01	0,5 μM	2 μM	5 μM	0.5 μM
B27	1x	1x	1x	1x
B27 sans vitamine A	-	-	1x	-
Forskoline	-	-	10 μM	-
hFGF-10	-	200 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml
hHGF	-	-	25 ng/ml	-
[Leu15] Gastrin	10 nM	1 nM	10 nM	10 nM
mEGF	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml
N2	-	-	1x	-	1x
N-acétyl-L-cystéine	1,25 million d’euros	1 million d’euros	1 million d’euros	1 mM
Nicotinamide	10 millions d’euros	10 millions d’euros	10 millions d’euros	10 mM
Caboche	10 %	10 %	-	10 %
Primocin	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)
Prostaglandine E2	10 nM	-	-	-	1 μM
Rspondin	20 %	10 %	10 %	10 %
SB202190	3μM	-	-	-
Wnt3A	50 %	50 %	-	50 %
*Tampon chélateur : 5,6 mM Na2HPO4, 8,0 mM KH2PO4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM saccharose, 54,9 mM d-sorbitol, 0,5 mM dl-dithiothreitol dans de l’eau distillée

Résultats

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
[Leu15] Gastrin	Sigma-Aldrich	Référence G9145
N° A83-01	Tocris Bioscience	Référence 2939
DMEM/F-12 avancé	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
Supplément de B27, moins la vitamine A	Thermo Fisher Scientific	12587010
CHIR99021	Tige	04-2004
Collagénase II	Technologies de la vie	Référence 17101-015
Collagénase XI	Sigma-Aldrich	Réf. C9407-100MG
Collagénase D	Roche	11088866001
Dispase II	Roche	4942078001
Dnase I	Sigma-Aldrich	D5319
D-sorbitol	Roth	Référence 6213.1
Le dithiothréitol	Thermo Scientific	1859330
Edta	Roth	Référence 8040
Forskoline	Tocris Bioscience	N° 1099
Glutamax	Technologies de la vie	35050061
Hepes	Thermo Fisher Scientific	15630106
hFGF-10	Préprotech	100-26
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Roth	Référence 3904.2
Matrigel	Corning	356231	matrice de sous-sol
mEGF	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
NaCl	Roth	Référence 3957.1
Na2HPO4	Roth	K300.2
N-acétyl-L-cystéine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Caboche	N.A.	N.A.	Milieu conditionné produit à partir de cellules HEK293 (Hek293- mNoggin-Fc)
HGF humain recombinant	Préprotech	100 à 39 H
Rspondin	N.A.	N.A.	Fluide conditionné produit à partir de cellules HEK293 (HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067
TrypLE Express	Gibco	12604021	Réactif de dissociation
Wnt3A	N.A.	N.A.	Milieu conditionné produit à partir de cellules L-Wnt3a (de Sylvia Boj)
Y-27632	Sigma-Aldrich	N° Y0503
Plaque à 48 puits	Corning	Référence 3548
Cuvettes d’électroporation Nepa à 2 mm d’espace avec pipettes	Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
Électroporateur Nepa21	Nepa Gene Co., Ltd.	N.A.
EVOS FL Auto	Invitrogen	AMAFD1000	Microscope à fluorescence
EndoFree Plasmide Maxi Ki	Qiagen	Référence 12362
Opti-MEM	Gibco	31985047	Tampon d’électroporation
2 vecteur concatéreur d’ARNg	AddGene	Référence 84879
Plasmide PX458	AddGene	Référence 48138	codant pour l’ARNsg et Cas9
px458_Conc2 plasmide	AddGene	134449	plasmide px458 contenant 2x promoteurs, U6, pour deux ARNsg différents