1. Digestion des tumeurs pancréatiques
- Placez la tumeur pancréatique disséquée, les tumeurs du site métastatique ou le tissu pancréatique sain dans du PBS glacé et stockez-le sur de la glace.
- Utilisez des pinces pour transférer la tumeur sur une boîte de Pétri.
- Ajouter 5,0 mL de milieu de digestion (2 mg/mL de collagénase, 0,025 mg/mL de DNase RPMI) dans un tube de 50 mL ; stocker sur de la glace pour empêcher l’activité enzymatique de commencer.
note: Ce protocole utilise la collagénase de type V, qui a une activité de ≥1 unités/mg de FALGPA et > 125 unités de digestion de collagène (CDU)/mg solide. Les aliquotes de la collagénase et de la DNase peuvent être conservées à -20 °C et décongelées sur de la glace avant utilisation. Lorsque les deux sont complètement solubilisés dans un RPMI stérile, ils peuvent être passés à travers un filtre de 0,2 μm pour éliminer les contaminants. La collagénase doit être complètement solubilisée avant d’être filtrée pour éviter la perte de matière.
- Prenez une petite aliquote de cette solution pour couvrir la tumeur sur la boîte de Pétri.
- Utilisez un scalpel stérile et une pince pour couper la tumeur en petits morceaux, d’environ moins de 3 mm de longueur.
- Grattez les morceaux de tumeur dans le tube et retournez doucement le tube jusqu’à ce que tous les morceaux soient immergés dans le milieu de digestion. Stocker sur de la glace si d’autres échantillons de tumeurs doivent être préparés en un lot.
- Transférer sur un appareil à agiter pendant 20 min à 37 °C. Assurez-vous que tous les morceaux de tumeur sont immergés et ne sont pas collés au bord du tube. S’il n’est pas possible d’agiter, agitez l’échantillon toutes les 5 minutes pour faciliter la digestion.
2. Préparation de suspension unicellulaire à partir d’une tumeur digérée
- Immédiatement après l’étape de digestion, placez le tube sur de la glace pour ralentir l’activité enzymatique.
- Ajouter de l’EDTA pour obtenir une concentration finale de 20 mM et un bref vortex d’échantillon à mélanger. Cela ralentira davantage l’activité enzymatique.
- Ouvrez le tube et rincez toute digestion tumorale du couvercle du tube avec un milieu RPMI frais.
- Préparez une passoire de 70 m (la taille de la passoire peut être modifiée à volonté) sur un tube ouvert de 50 mL, sur de la glace.
- Pré-mouillez le filtre avec du fluide.
- Remettez en suspension les cellules digérées et lavez les côtés du tube à l’aide d’une bande de 25 ml ou plus. L’ouverture plus large de la bande est importante pour permettre à la digestion épaisse de passer facilement.
- Transférez toute la digestion, à l’aide de la bande de 25 ml, dans la passoire.
- Écrasez la tumeur sur le dessus du filtre à l’aide d’un piston de seringue de 1 ml. Écrasez uniquement directement de haut en bas pour minimiser les contraintes de cisaillement sur les cellules.
- Laver continuellement les cellules à travers la crépine avec RPMI. Assurez-vous de laver avec suffisamment de force pour pousser les cellules à travers.
- S’il reste du matériau à écraser, mais que le RPMI cesse de s’écouler, la crépine sera saturée. Transférez donc l’échantillon dans un nouveau filtre et continuez.
note: Finalement, seuls les composants de la matrice extracellulaire resteront dans le filtre, toutes les cellules individuelles devraient être passées à travers.
- Centrifugez le tube pendant 5 min à 300 x g et 4 °C.
- Remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire dans un RPMI complet et passez-la directement à travers un autre filtre pour éliminer toute matrice extracellulaire ou gros amas de cellules qui ne peuvent pas être remis en suspension de manière adéquate.
- À ce stade, si aucune stimulation n’est nécessaire, colorez immédiatement les cellules isolées pour l’analyse par cytométrie en flux en sautant pour centrifuger la plaque pendant 5 min à 300 x g et 4 °C. Retirez le surnageant en retournant la plaque d’un mouvement brusque. Vous pouvez également les remettre en suspension dans un milieu de congélation (10 % de DMSO dans le FBS) et les stocker à -80 °C, puis les stocker à long terme dans de l’azote liquide
note: L’étape de congélation peut permettre la purification des cellules immunitaires à une date ultérieure ; Cependant, la quantification des sous-ensembles de cellules immunitaires peut nécessiter une optimisation pour confirmer que le nombre de cellules et le phénotype ne sont pas affectés par le processus de congélation/décongélation. La stimulation ex vivo des lymphocytes T est mieux réalisée sur des échantillons de tumeurs fraîches. À ce stade, l’échantillon peut être purifié davantage par des tests d’élimination des cellules mortes à base de billes ou d’enrichissement des cellules immunitaires si nécessaire.
3. Préparation des cellules pour la stimulation ex vivo
- Compter les cellules jusqu’à obtenir une concentration de 2 x 106/ 100 μL dans un milieu complet (RPMI 10 % FBS, 1X pénicilline et 1X streptomycine).
note: Le nombre élevé de cellules totales plaquées garantit qu’il y aura suffisamment de cellules T dans cet échantillon à analyser. Cependant, le nombre peut être augmenté ou réduit en fonction de la disponibilité de l’échantillon et de la rareté des sous-ensembles de cellules T d’intérêt.
- Plaque de 100 μL de cellules dans une plaque à fond en U de 96 puits.
- Ajouter 100 μL de milieu complet contenant une préparation 2x de PMA/ionomycine (pour obtenir une concentration finale de 0,081 μM et 1,34 μM, respectivement, comme recommandé par le fabricant).
note: Si vous mesurez la dégranulation/exocytose, incluez également ici un anti-souris CD107a conjugué par fluorescence dans le milieu. Un échantillon de contrôle qui ne contient pas de CD107a doit également être effectué.
- Placer dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 1 h.
- Ajouter 20 μL d’une préparation 10x de bréfeldine A et de monensin (pour obtenir une concentration finale de 1,06 μM et 2,0 μM, respectivement (comme recommandé par le fabricant) dans un milieu complet.
note: La brefeldine A et le monensin sont des inhibiteurs du transport des protéines et bloquent ainsi la libération extracellulaire de cytokines, etc., permettant leur détection par cytométrie en flux. Si vous mesurez la libération de cytokines dans le surnageant par ELISA ou par des méthodes similaires, cette étape peut être ignorée.
- Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h supplémentaires.
