Imagerie de la dynamique calcique dans les cellules pancréatiques : une technique pour étudier les changements en temps réel de la concentration de calcium cytosolique dans les îlots pancréatiques

Résumé

Source : Hamilton, A., et. al. Imagerie de la dynamique calcique dans des sous-populations de cellules d’îlots pancréatiques de souris. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la technique d’imagerie des cellules des îlots pancréatiques en temps réel, pour étudier les changements de la concentration cytosolique de calcium dans les sous-populations mineures des cellules des îlots pancréatiques. Des sous-populations cellulaires mineures peuvent être identifiées à l’aide de réponses fonctionnelles à des composés marqueurs, tels que l’adrénaline et la ghréline, qui induisent des changements dans le calcium cytosolique dans des populations spécifiques de cellules d’îlots pancréatiques. Cela peut donner un aperçu de l’interaction entre la glycémie et la sécrétion des îlots.

Protocole

1. Chargez le colorant ou exprimez le capteur

1. Préparez le colorant trappable.
   1. Dissoudre l’aliquote (normalement, 50 μg) du colorant piégeable (p. ex., Fluo-4) dans du DMSO jusqu’à une concentration de stock de 2 mM. Ajouter de l’acide pluronique à une concentration finale de 1 % (en utilisant un stock de 20 % dans du DMSO), pour améliorer la solubilisation du colorant.
   2. Aliquote le colorant dans de petits tubes PCR (2 μL dans chacun). Le colorant peut être conservé congelé (-20 °C) pendant plusieurs semaines.
2. Vous pouvez également préparer le capteur recombinant.
   1. Répartissez le capteur (par exemple, le vecteur adénoviral codant pour GCaMP6f) dans des aliquotes de 10 μL et stockez-le à -80 °C.
   2. (Optionnellement) pré-tester le titre du stock viral en infectant des îlots (comme ci-dessous) à l’aide de plusieurs dilutions en série, afin de révéler la concentration optimale pour l’infection.
      note: Les capteurs recombinants codés par différents vecteurs (lentivirus, BacMam, AAV) nécessitent un protocole d’infection différent. Assurez-vous de vérifier cela auprès du fournisseur de vecteurs et d’optimiser le rapport de travail en fonction de vos besoins. Le stock « de travail » de l’adénovirus peut être stocké à -20 °C et congelé/décongelé plusieurs fois. Un cycle de gel-dégel excessif réduit le titre efficace du virus.
3. Préparez la solution d’imagerie.
   1. Composer la solution d’imagerie, mM : 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, avec NaOH).
   2. Constituez un stock de glucose (0,5 M) et de mannitol (0,5 M) dans la solution d’imagerie. Le bouillon peut être conservé au réfrigérateur (4 °C) pendant plusieurs semaines.
4. Chargez le colorant piégeable.
   1. Préparez la solution de travail du colorant en dissolvant 2 μL du colorant dans 600 μL de la solution d’imagerie contenant 6 mM de glucose. La solution peut être chauffée ou vortex pour améliorer la solubilisation.
   2. Chargez les îlots isolés dans la solution de travail du colorant. Le chargement peut être effectué à l’aide d’une plaque multipuits ou d’une boîte de Pétri. Dans ce dernier cas, placez une gouttelette de 100 μL de la solution de travail au fond d’une boîte de Pétri non adhésive (35 ou 60 mm) et pipetez 10 à 30 îlots dans la gouttelette.
   3. Dans le cas de différents groupes d’îlots (par exemple, de type sauvage/knock-out), disposez plusieurs puits et plusieurs gouttelettes de manière à ce que le chargement puisse être effectué simultanément.
   4. Incuber les îlots dans la solution de travail de teinture à température ambiante dans l’obscurité pendant 70 à 90 minutes. Ne pas trop incuber.
   5. Vérifiez la charge au microscope à fluorescence ; les îlots doivent acquérir une légère fluorescence, certaines cellules étant plus brillantes que les autres. L’arrondi des cellules et la localisation nucléaire du colorant sont des signes de surcharge.
   6. Transférez les îlots dans une solution d’imagerie sans colorant contenant 6 mM de glucose. Les îlots peuvent être utilisés pour l’imagerie immédiatement, mais en option, le colorant peut être laissé à se désestérifier pendant encore 10 à 15 minutes. Les îlots conserveront le colorant pendant plusieurs heures et peuvent donc être utilisés pour l’imagerie en plusieurs équipes.
5. Vous pouvez également infecter les îlots avec le vecteur recombinant.
   1. Plaquez les îlots en gouttelettes dans un milieu de culture RPMI (RMPI1640 (voir le tableau des matières), complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 100 unités/ml de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine. Répartissez le fluide dans deux boîtes de Pétri en plastique de 60 mm (non traitées avec un adhésif) et conservez les boîtes dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO₂, humidité absolue)). (p. ex., 30 μL), afin de minimiser le volume de vecteur nécessaire.
   2. Ajouter le vecteur dans un rapport d’environ 10^{à 5} unités/îlot infectieux qui devrait idéalement entraîner une multiplicité d’infection >2. Idéalement, le rapport devrait être optimisé au rapport minimal qui permettrait de s’exprimer dans la couche périphérique. Le pré-titrage (étape 1.2.2) peut aider.
   3. Introduisez 20 à 50 îlots dans la gouttelette et cultivez-les pendant 8 à 48 heures. (Idéalement, toute la nuit). Les îlots doivent développer une faible fluorescence verte dans la plupart des cellules, sans modification de la morphologie cellulaire.
      note: Le succès de l’infection et de l’expression dépend du temps d’exposition à la solution virale. Idéalement, le virus devrait rester dans la solution pendant la nuit, mais peut être éliminé en option après aussi peu que 15 minutes. Cependant, l’infectiosité, et donc l’expression, est susceptible d’être considérablement plus faible.

2. Imagerie de la dynamique Ca²⁺

1. Immobiliser les îlots au microscope (inversé).
   1. Assemblez la chambre d’imagerie pour la microscopie inversée. Positionnez la lamelle en verre (épaisseur 1 ou 1,5) à l’intérieur de la chambre et assurez-vous que l’interface verre-chambre est étanche. Vérifiez que la lamelle est à portée de l’objectif du microscope (ce qui est essentiel dans le cas d’un objectif volumineux à grande ouverture numérique).
   2. Préparez les accessoires d’immobilisation. Découpez de petits rectangles (20 mm x 20 mm) dans les mailles fines et les mailles grossières. Introduisez deux « parois » d’espacement sur le maillage fin à l’aide d’un ruban adhésif de 45 à 50 μm d’épaisseur. Utilisez des couches doubles de l’espaceur si la taille des îlots à imager dépasse considérablement les 100 μm conventionnels.
   3. Immergez les mailles et le poids dans la solution d’imagerie à l’aide d’une boîte de Pétri de 35 mm. Assurez-vous que le plastique et le métal sont mouillés.
   4. À l’aide d’un microscope à dissection, retournez le maillage fin avec les « parois » de l’espaceur, les entretoises vers le haut. Prélevez plusieurs îlots chargés avec le colorant trappable ou exprimant le capteur recombinant avec une pipette P20 et positionnez-les doucement sur le dessus de la maille fine, entre les deux entretoises. Assurez-vous que le treillis et les rondelles ne contiennent pas de quantités excessives de solution d’imagerie.
   5. Prenez le grillage avec les îlots, à l'aide d'une pince d'horloger, et positionnez-le à l'envers à l'intérieur de la chambre d'imagerie, de sorte que les entretoises soient orientées vers le bas et reposent directement sur la lamelle de la chambre. Assurez-vous que les îlots sont coincés entre les entretoises et le grillage, au milieu de la lamelle.
   6. Positionnez le maillage grossier et le poids sur le maillage fin à l’intérieur de la chambre. Introduisez la solution d’imagerie dans la chambre. Assurez-vous que les îlots sont immobilisés et prêts à être imagés. Évitez de secouer excessivement la chambre (de petites perturbations comme le transport de la chambre vers le microscope et l’insertion dans une platine chauffée sont acceptables).
      note: Un dispositif d’immobilisation similaire peut être appliqué pour un système vertical.
2. Installez le microscope.
   1. Choisissez le mode d’imagerie et l’objectif, positionnez la chambre avec les îlots de l’étape 2.1 sur la platine à température contrôlée du microscope.
      1. Réglez le contrôle de la température (idéalement, entre 30 °C et 36 °C) et la perfusion. Pour un système inversé, positionnez l’entrée plus bas que l’écoulement sortant dans la chambre et réglez le flux d’écoulement extérieur pour qu’il soit supérieur à celui de l’écoulement entrant (ce qui est généralement réalisé en utilisant un tube d’un diamètre intérieur plus large sur une pompe péristaltique).
      2. Assurez-vous que l’écoulement a une surface de contact minimale avec la solution, de sorte qu’il élimine la solution en plusieurs petites gouttelettes séquentielles, évitant ainsi de longs intervalles d’élimination continue de la solution. Ce dernier est la principale source d’artefacts dans l’imagerie en accéléré des signaux périodiques, car ils apparaissent comme des oscillations d’intensité périodiques régulières de chaque pixel imagé et sont fréquemment interprétés comme des « ondes lentes ».
      3. Amorcez la perfusion avec la solution d’imagerie contenant 3 mM de glucose.
   2. Choisissez le trajet lumineux et les filtres pour l’imagerie des fluorophores verts ; une excitation entre 470 et 500 et une émission entre 505 et 550 fonctionneraient pour chacun d’eux.
   3. Exécutez l’imagerie en direct pour configurer les paramètres d’imagerie. Ajustez la vue pour capturer les îlots qui vous intéressent.
   4. Optimiser le rapport signal/bruit de l’image. Pour ce faire, ajustez l’intensité lumineuse d’excitation, le temps d’exposition et le binning. Assurez-vous que les paramètres permettent une visualisation distincte de chaque cellule à l’intérieur de l’îlot avec l’intensité lumineuse et l’exposition minimales possibles.
   5. Effectuer l’acquisition d’images. Selon la tâche, les images peuvent être prises entre 0,1 et 5 Hz. C’est bien en dessous des critères de Nyquist pour les oscillations rapides pilotées par Na⁺ dans les cellules α et δ (>300 Hz), ce qui signifie que les données sont sous-échantillonnées par défaut. Cependant, il n’est pas possible d’augmenter la fréquence d’acquisition pour répondre à cette demande dans le cadre de l’imagerie multicellulaire/multi-îlots avec un large champ de vision. GCaMP peut être imagé plus rapidement, tandis que Fluo4 blanchira inévitablement dans des conditions d’acquisition rapide.
      note: Étant donné que les oscillations de [Ca²⁺]_cyt dans les cellules des îlots sont entraînées par l’activité électrique, l’utilisation de faibles taux d’acquisition peut sembler contre-productive. En réalité, cependant, des taux d’acquisition autour ou au-dessus de 1 Hz peuvent être suffisants pour résoudre le comportement de dopage des cellules β, alors que le seuil de détection des oscillations induites par les canaux sodiques dans les cellules α et δ est bien supérieur à 300 Hz. Que les oscillations _{de la cellule} α ou δ [Ca²⁺] soient acquises à 1 Hz ou 0,1 Hz, elles seront sévèrement sous-échantillonnées et refléteront la manipulation du Ca²⁺ par la cellule plutôt que l’activité électrique.
      1. Vérifiez la qualité des données acquises : à 3 mM de glucose, l’activité des cellules α doit être clairement visible/détectable. Assurez-vous que c’est le cas et passez à l’imagerie time-lapse à grande échelle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif 40x/1,3
GCaMP6f, dans le vecteur adénoviral (type 5 humain)	Biolabs vectoriels	1910
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
RPMI moyen	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Microscope Axiovert 200
Fluo4	Thermo Fisher (Life Technologies)	Réf. F14201