Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire jolive.
1. Isolement des cellules acineuses
- Sacrifiez la souris via l’induction de CO2 et effectuez une luxation cervicale. Disséquez immédiatement le pancréas. Pour disséquer le pancréas, épinglez d’abord les pattes de la souris sur le couvercle en polystyrène, orientez la souris de manière à ce que la queue soit face au chercheur et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
note: La souris utilisée dans les résultats représentatifs était une femelle non transgénique de 12 semaines avec des antécédents C57BL/6. La sélection de la souris est abordée plus en détail dans la section de discussion.
- À l’aide d’un ensemble de ciseaux et de pinces autoclavés, soulevez la fourrure/la peau avec la pince sur la ligne médiane et utilisez les ciseaux pour faire une incision à travers la fourrure et la peau de l’ouverture urétrale à la zone du diaphragme/de la cage thoracique.
- Faites des incisions supplémentaires à gauche et à droite de sorte que la fourrure / la peau soit coupée pour créer une vue claire de la cavité abdominale. Ensuite, coupez la muqueuse péritonéale (au milieu et à droite et à gauche) et retirez-la des organes, comme cela a été fait avec la fourrure/la peau.
- Soulevez les intestins avec la pince et placez-le sur le côté gauche de la souris pour créer un espace pour voir le pancréas, qui est de couleur rose clair, et attaché à la rate, qui est un ovale rouge foncé. Le tissu pancréatique se distingue par sa texture molle et spongieuse. Découpez le pancréas qui longera l’estomac et s’entremêlera avec les intestins.
- Séparez la rate du pancréas. Ensuite, placez le pancréas dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de HBSS avec 1x pénicilline-streptomycine et apportez-le dans la hotte à flux laminaire.
note: Les étapes restantes du protocole doivent être réalisées en utilisant une technique stérile dans une hotte à flux laminaire.
- Versez le pancréas et le HBSS (avec pénicilline-streptomycine) dans un bateau de pesée vide et, à l’aide d’une pince, lavez le pancréas en le faisant tourner. Ensuite, déplacez le pancréas avec la pince vers un deuxième bateau de pesée contenant HBSS (avec pénicilline-streptomycine). Encore une fois, lavez le pancréas en remuant.
- Déplacez le pancréas vers le troisième bateau de pesée contenant du HBSS (avec pénicilline-streptomycine) et commencez à couper le pancréas en petits morceaux de 5 mm ou moins. Ensuite, versez les morceaux de pancréas et le HBSS dans un tube vide de 50 ml.
- Pour ce faire, utilisez la pince pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide pendant que le bateau de pesée est basculé. Versez une fois que toutes les pièces ne sont plus attachées au bateau de pesée. Ramassez les morceaux restants à l’aide de la pince et lavez-les dans le tube de 50 ml contenant le pancréas dans HBSS avec de la pénicilline-streptomycine.
- Centrifugez à 931 x g pendant 2 min à 4 °C, puis retirez le HBSS (et toute graisse flottante) en le pipetant avec une pipette de 5 ml.
- Ajouter 5 mL de collagénase (faire 40 mL de HBSS + 5 % de FBS, 20 mL de HBSS + 30 % de FBS et 5 mL de 2 mg/mL de collagénase dans HBSS. Stérilisez la collagénase par filtration (pore de 0,22 μm) et conservez-la à température ambiante. Gardez chacune des solutions HBSS sur de la glace) au pancréas. Assurez-vous que le couvercle est scellé en enveloppant le tube de 50 ml dans une pellicule de paraffine plastique, puis placez-le dans un incubateur en le secouant à 220 tr/min pendant 20 min à 37 °C
note: Le temps de digestion de la collagénase peut varier, comme indiqué dans la discussion. À la fin de l’incubation, il ne doit rester aucun gros morceau de tissu.
- Pour arrêter la dissociation, placez le tube contenant le pancréas sur de la glace et ajoutez 5 mL de HBSS froid + 5 % FBS. Centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 °C, puis pipeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL.
- Remettre en suspension dans 10 mL de HBSS + 5 % de FBS et centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL et répéter cette étape avec 10 mL de HBSS + 5 % de FBS
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- Remettre en suspension dans 5 mL de HBSS + 5 % FBS et, à l’aide d’un P1000, transférer 1 mL à la fois à travers une maille de 500 μm dans un tube de 50 mL. Ajoutez 5 ml supplémentaires de HBSS + 5 % de FBS à travers le maillage avec un P1000 pour laver toutes les cellules pancréatiques restantes à travers le treillis.
- Placez la suspension cellulaire de la maille de 500 μm à travers la maille de 105 μm en pipetant 1 mL à la fois à l’aide d’un P1000. Ensuite, pipetez doucement la suspension cellulaire dans un tube contenant HBSS + 30 % FBS. Une couche de suspension cellulaire se formera au sommet ; Lors de la centrifugation, les cellules acineuses vont couler pour former une pastille.
- Centrifuger à 233 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 milieu complet de Waymouth.
- Si vous procédez directement à l’incorporation de cellules dans le collagène ou la matrice de la membrane basale, remettre en suspension dans un volume de 7 mL par pancréas. En cas d’infection adénovirale ou lentivirale, remettre en suspension dans 4 mL par pancréas.
