Isolement de cellules acineuses primaires : une méthode pour isoler des cellules acineuses du pancréas de souris

Résumé

Source : Fleming Martinez, A. K., et al. Imitation et manipulation de la métaplasie acineuse-canalaire pancréatique dans la culture cellulaire tridimensionnelle. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la technique utilisée pour isoler les cellules acineuses pancréatiques - des cellules exocrines - contenant une variété d’enzymes digestives. Les cellules acineuses primaires sont utiles dans l’étude ex vivo de la métaplasie acineuse-canalaire (MAA), un événement précoce du développement du cancer du pancréas.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire jolive.

1. Isolement des cellules acineuses

1. Sacrifiez la souris via l’induction de CO₂ et effectuez une luxation cervicale. Disséquez immédiatement le pancréas. Pour disséquer le pancréas, épinglez d’abord les pattes de la souris sur le couvercle en polystyrène, orientez la souris de manière à ce que la queue soit face au chercheur et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
   note: La souris utilisée dans les résultats représentatifs était une femelle non transgénique de 12 semaines avec des antécédents C57BL/6. La sélection de la souris est abordée plus en détail dans la section de discussion.
   1. À l’aide d’un ensemble de ciseaux et de pinces autoclavés, soulevez la fourrure/la peau avec la pince sur la ligne médiane et utilisez les ciseaux pour faire une incision à travers la fourrure et la peau de l’ouverture urétrale à la zone du diaphragme/de la cage thoracique.
   2. Faites des incisions supplémentaires à gauche et à droite de sorte que la fourrure / la peau soit coupée pour créer une vue claire de la cavité abdominale. Ensuite, coupez la muqueuse péritonéale (au milieu et à droite et à gauche) et retirez-la des organes, comme cela a été fait avec la fourrure/la peau.
   3. Soulevez les intestins avec la pince et placez-le sur le côté gauche de la souris pour créer un espace pour voir le pancréas, qui est de couleur rose clair, et attaché à la rate, qui est un ovale rouge foncé. Le tissu pancréatique se distingue par sa texture molle et spongieuse. Découpez le pancréas qui longera l’estomac et s’entremêlera avec les intestins.
   4. Séparez la rate du pancréas. Ensuite, placez le pancréas dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de HBSS avec 1x pénicilline-streptomycine et apportez-le dans la hotte à flux laminaire.
      note: Les étapes restantes du protocole doivent être réalisées en utilisant une technique stérile dans une hotte à flux laminaire.
2. Versez le pancréas et le HBSS (avec pénicilline-streptomycine) dans un bateau de pesée vide et, à l’aide d’une pince, lavez le pancréas en le faisant tourner. Ensuite, déplacez le pancréas avec la pince vers un deuxième bateau de pesée contenant HBSS (avec pénicilline-streptomycine). Encore une fois, lavez le pancréas en remuant.
3. Déplacez le pancréas vers le troisième bateau de pesée contenant du HBSS (avec pénicilline-streptomycine) et commencez à couper le pancréas en petits morceaux de 5 mm ou moins. Ensuite, versez les morceaux de pancréas et le HBSS dans un tube vide de 50 ml.
   1. Pour ce faire, utilisez la pince pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide pendant que le bateau de pesée est basculé. Versez une fois que toutes les pièces ne sont plus attachées au bateau de pesée. Ramassez les morceaux restants à l’aide de la pince et lavez-les dans le tube de 50 ml contenant le pancréas dans HBSS avec de la pénicilline-streptomycine.
4. Centrifugez à 931 x g pendant 2 min à 4 °C, puis retirez le HBSS (et toute graisse flottante) en le pipetant avec une pipette de 5 ml.
5. Ajouter 5 mL de collagénase (faire 40 mL de HBSS + 5 % de FBS, 20 mL de HBSS + 30 % de FBS et 5 mL de 2 mg/mL de collagénase dans HBSS. Stérilisez la collagénase par filtration (pore de 0,22 μm) et conservez-la à température ambiante. Gardez chacune des solutions HBSS sur de la glace) au pancréas. Assurez-vous que le couvercle est scellé en enveloppant le tube de 50 ml dans une pellicule de paraffine plastique, puis placez-le dans un incubateur en le secouant à 220 tr/min pendant 20 min à 37 °C
   note: Le temps de digestion de la collagénase peut varier, comme indiqué dans la discussion. À la fin de l’incubation, il ne doit rester aucun gros morceau de tissu.
6. Pour arrêter la dissociation, placez le tube contenant le pancréas sur de la glace et ajoutez 5 mL de HBSS froid + 5 % FBS. Centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 °C, puis pipeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL.
7. Remettre en suspension dans 10 mL de HBSS + 5 % de FBS et centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL et répéter cette étape avec 10 mL de HBSS + 5 % de FBS
.
8. Remettre en suspension dans 5 mL de HBSS + 5 % FBS et, à l’aide d’un P1000, transférer 1 mL à la fois à travers une maille de 500 μm dans un tube de 50 mL. Ajoutez 5 ml supplémentaires de HBSS + 5 % de FBS à travers le maillage avec un P1000 pour laver toutes les cellules pancréatiques restantes à travers le treillis.
9. Placez la suspension cellulaire de la maille de 500 μm à travers la maille de 105 μm en pipetant 1 mL à la fois à l’aide d’un P1000. Ensuite, pipetez doucement la suspension cellulaire dans un tube contenant HBSS + 30 % FBS. Une couche de suspension cellulaire se formera au sommet ; Lors de la centrifugation, les cellules acineuses vont couler pour former une pastille.
10. Centrifuger à 233 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 milieu complet de Waymouth.
    1. Si vous procédez directement à l’incorporation de cellules dans le collagène ou la matrice de la membrane basale, remettre en suspension dans un volume de 7 mL par pancréas. En cas d’infection adénovirale ou lentivirale, remettre en suspension dans 4 mL par pancréas.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur à agitation 37 °C	Thermo Scientific	SHKE4000-7
Incubateur 5 % CO2, 37 °C	NUAIRE	NU-5500
Tubes de 50 ml	Faucon	Référence 352070
Tampon absorbant, 20 » x 24 »	Fisherbrand	1420662
Aiguille BD Precision Glide 21G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Utilisation comme broches pour la dissection
Bécher, 600 mL	Fisherbrand	Référence : FB-101-600
centrifugeuse	Beckman Coulter	Centrifugeuse Allegra X-15R
Collagénase de type I, Clostridium histolyticum	sigma	Réf. C0130-1G	Créez une solution à 100 mg/ml en dissolvant la poudre dans de l’eau stérile de biologie moléculaire. Lors de la décongélation d’une aliquote, diluer à 10 mg/ml, filtrer stériliser et placer 1 ml d’aliquotes à -20 °C.
dexaméthasone	sigma	D1756	Créer une solution à 4 mg/ml en dissolvant la poudre dans du méthanol, en l’aliquote et en la stockant à -20 °C.
Éthanol, 200 proof	Laboratoires Decon	Référence 2701
Sérum fœtal bovin	sigma	F0926-100mL
forceps	Outils scientifiques fins	Référence 11002-12
forceps	Outils scientifiques fins	Référence 91127-12
Solution saline équilibrée Hank's (HBSS), sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol	Fisher Scientific	SH3048801
Seau à glace, rectangulaire	Fisher Scientific	Référence 07-210-103
Sacs d’échantillons LAB GUARD (pour souris après dissection)	Minigrip	SBL2X69S
Parafilm	Bemis	Réf. PM992	Appelé « film de paraffine plastique » dans le manuscrit
Pbs	Fisher Scientific	SH30028.02
Pénicilline-streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140122
Pointes de pipette, 10 μl	Scientifique américain	Référence 1110-3700
Pointes de pipette, 1000 μl	Olympus Plastics	24-165RL
Pointes de pipette, 200 μl	Scientifique américain	Référence 1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipettes, 10 ml	Faucon	357551
Pipettes, 25 ml	Faucon	357525
Pipettes, 5 ml	Faucon	357543
Maille en polypropylène, 105 μm	Laboratoires Spectrum	146436
Maille en polypropylène, 500 μm	Laboratoires Spectrum	146418
ciseaux	Outils scientifiques fins	Référence 14568-12
ciseaux	Outils scientifiques fins	Référence 14568-13
Bicarbonate de sodium (poudre blanche fine)	Fisher Scientific	BP328-500
hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-500
Inhibiteur de la trypsine de soja	Gibco	17075029
spatule	Fisherbrand	Référence 21-401-10
Filtres Steriflip 50 ml, 0,22 micron	Millipore	SCGP00525
Collagène de queue de rat de type I	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (poudre)	sigma	W1625-10X1L
Poids bateau, hexagonal, moyen	Fisherbrand	Référence 02-202-101