Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des matériaux, des solutions et des bases matricielles tridimensionnelles
- Découpez des mailles en polypropylène de 500 μm et 105 μm en carrés de 76 mm par 76 mm. Pliez chaque carré en deux deux deux fois pour créer un carré plié plus petit. Placez un carré à mailles de 500 μm et un carré de 105 μm dans un sachet autoclave.
- Carrés en maille de polypropylène autoclave, ainsi que deux paires de ciseaux et de pinces.
- Préparez 100 ml de solution 10x Waymouth. Incorporer 1 fiole (14 g) de poudre Waymouth's dans 50 mL d'eau désionisée (DI) et, une fois dissoute, ajouter 30 mL de bicarbonate de sodium à 7,5 % (75 g/L). Porter le volume final à 100 mL avec de l’eau DI et stériliser par filtre.
- Conservez 10 milieux Waymouth à 4 °C et utilisez-les pour préparer des gels de collagène et 1 milieu Waymouth. Lorsque des précipités se forment, jetez-les.
- Préparez 50 ml de 1 milieu complet Waymouth par pancréas en ajoutant 125 μL d'inhibiteur de la trypsine de soja à 40 mg/mL, 12,5 μL de dexaméthasone à 4 mg/mL et 500 μL de sérum fœtal bovin (FBS). Stériliser par filtration et utiliser dans les 48 h.
- Préparez des bases matricielles tridimensionnelles en utilisant du collagène ou une matrice de membrane basale (voir la table des matériaux pour plus d’informations sur le produit). Lorsque vous pipetez la base, placez la plaque sur de la glace, évitez les bulles et tournez la plaque immédiatement après avoir pipeté le volume de chaque puits pour assurer une couverture complète.
- Créez des bases de collagène en mélangeant les composants suivants sur de la glace dans une hotte de culture tissulaire : 5,5 ml de collagène de queue de rat de type I, 550 μL de 10 milieux Waymouth et 366,6 μL de 0,34 M de NaOH (filtré).
REMARQUE : C’est une solution suffisante pour faire des bases de collagène pour une plaque de 24 puits, 12 puits ou 6 puits. Une seule plaque suffit pour l’isolement de l’acinaire d’un pancréas.
- Utilisez les volumes suivants pour plaquer la base de collagène : 80 μL (lame de verre à 8 puits), 200 μL (plaque à 24 puits), 400 μL (plaque à 12 puits) ou 800 μL (plaque à 6 puits).
- Pour les bases de matrice de membrane basale, pipetez la matrice sans aucun composant supplémentaire. Utilisez les volumes suivants pour chaque puits : 50 μL (lame de verre à 8 puits), 120 μL (plaque à 24 puits), 240 μL (plaque à 12 puits) ou 600 μL (plaque à 6 puits).
- Laissez les bases se solidifier pendant au moins 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2) avant de créer une deuxième couche de matrice avec des cellules intégrées au-dessus de ces bases.
- En prévision de l’isolement de l’acineux, gardez un bécher de 600 ml, trois tubes de 50 ml, une paire de ciseaux autoclavés, une paire de pinces autoclavées et un seau à glace sous le capot avec trois bateaux de pesée. Ensuite, préparez 30 ml de HBSS avec 300 μL de pénicilline-streptomycine 100x, en mettant 10 ml dans chacun des deux bateaux de pesée et en conservant les 10 derniers ml dans un tube de 50 ml (à utiliser aux étapes 1.8.2 et 2.1.4).
- Préparez 40 ml de HBSS + 5 % de FBS, 20 ml de HBSS + 30 % de FBS et 5 ml de 2 mg/ml de collagénase dans HBSS. Stérilisez la collagénase par filtration (pore de 0,22 μm) et conservez-la à température ambiante. Gardez chacune des solutions HBSS sur la glace.
- Assemblez un espace de travail pour le curage ganglionnaire du pancréas, ce qui peut être fait sur une paillasse de laboratoire.
- Placez un tampon absorbant sur la table, ainsi qu’un couvercle en polystyrène recouvert de papier d’aluminium. Placez ensuite une serviette en papier avec 4 épingles sur le papier d’aluminium.
- Gardez les articles suivants à portée de main de l’espace de travail de dissection : un sac d’incinération, un ensemble de ciseaux et de pinces autoclavés, un flacon pulvérisateur contenant de l’éthanol à 70 % et un seau à glace (avec le tube de 50 ml de HBSS contenant de la pénicilline-streptomycine de l’étape 1.6).
- Réglez une centrifugeuse à 4 °C et un agitateur à 37 °C.
2. Isolement des cellules acineuses
- Sacrifiez la souris via l’induction de CO2 et effectuez une luxation cervicale. Disséquez immédiatement le pancréas. Pour disséquer le pancréas, épinglez d’abord les pattes de la souris sur le couvercle en polystyrène, orientez la souris de manière à ce que la queue soit face au chercheur et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
REMARQUE : La souris utilisée dans les résultats représentatifs était une femelle non transgénique de 12 semaines avec des antécédents C57BL/6. La sélection de la souris est abordée plus en détail dans la section de discussion.
- À l’aide d’un ensemble de ciseaux et de pinces autoclavés, soulevez la fourrure/la peau avec la pince sur la ligne médiane et utilisez les ciseaux pour faire une incision à travers la fourrure et la peau de l’ouverture urétrale à la zone du diaphragme/de la cage thoracique.
- Faites des incisions supplémentaires à gauche et à droite de sorte que la fourrure / la peau soit coupée pour créer une vue claire de la cavité abdominale. Ensuite, coupez la muqueuse péritonéale (au milieu et à droite et à gauche) et retirez-la des organes, comme cela a été fait avec la fourrure/la peau.
- Soulevez les intestins avec la pince et placez-le sur le côté gauche de la souris pour créer un espace pour voir le pancréas, qui est de couleur rose clair, et attaché à la rate, qui est un ovale rouge foncé. Le tissu pancréatique se distingue par sa texture molle et spongieuse. Découpez le pancréas qui longera l’estomac et s’entremêlera avec les intestins.
- Séparez la rate du pancréas. Ensuite, placez le pancréas dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de HBSS avec 1x pénicilline-streptomycine et apportez-le dans la hotte à flux laminaire.
note: Les étapes restantes du protocole doivent être réalisées en utilisant une technique stérile dans une hotte à flux laminaire.
- Versez le pancréas et le HBSS (avec pénicilline-streptomycine) dans un bateau de pesée vide et, à l’aide d’une pince, lavez le pancréas en le faisant tourner. Ensuite, déplacez le pancréas avec la pince vers un deuxième bateau de pesée contenant HBSS (avec pénicilline-streptomycine). Encore une fois, lavez le pancréas en remuant.
- Déplacez le pancréas vers le troisième bateau de pesée contenant du HBSS (avec pénicilline-streptomycine) et commencez à couper le pancréas en petits morceaux de 5 mm ou moins. Ensuite, versez les morceaux de pancréas et le HBSS dans un tube vide de 50 ml.
- Pour ce faire, utilisez la pince pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide pendant que le bateau de pesée est basculé. Versez une fois que toutes les pièces ne sont plus attachées au bateau de pesée. Ramassez les morceaux restants à l’aide de la pince et lavez-les dans le tube de 50 ml contenant le pancréas dans HBSS avec de la pénicilline-streptomycine.
- Centrifugez à 931 x g pendant 2 min à 4 °C, puis retirez le HBSS (et toute graisse flottante) en le pipetant avec une pipette de 5 ml.
- Ajouter 5 ml de collagénase (diluée dans HBSS à l’étape 1.7) dans le pancréas. Assurez-vous que le couvercle est scellé en enveloppant le tube de 50 ml dans une pellicule de paraffine plastique, puis placez-le dans un incubateur en le secouant à 220 tr/min pendant 20 min à 37 °C
REMARQUE : Le temps de digestion de la collagénase peut varier, comme indiqué dans la discussion. À la fin de l’incubation, il ne doit rester aucun gros morceau de tissu.
- Pour arrêter la dissociation, placez le tube contenant le pancréas sur de la glace et ajoutez 5 mL de HBSS froid + 5 % FBS. Centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 °C, puis pipeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL.
- Remettre en suspension dans 10 mL de HBSS + 5 % de FBS et centrifuger à 931 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL et répéter cette étape avec 10 mL de HBSS + 5 % de FBS
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- Remettre en suspension dans 5 mL de HBSS + 5 % FBS et, à l’aide d’un P1000, transférer 1 mL à la fois à travers une maille de 500 μm dans un tube de 50 mL. Ajoutez 5 ml supplémentaires de HBSS + 5 % de FBS à travers le maillage avec un P1000 pour laver toutes les cellules pancréatiques restantes à travers le treillis.
- Placez la suspension cellulaire de la maille de 500 μm à travers la maille de 105 μm en pipetant 1 mL à la fois à l’aide d’un P1000. Ensuite, pipetez doucement la suspension cellulaire dans un tube contenant HBSS + 30 % FBS. Une couche de suspension cellulaire se formera au sommet ; Lors de la centrifugation, les cellules acineuses vont couler pour former une pastille.
- Centrifuger à 233 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 milieu complet de Waymouth.
- Si vous procédez directement à l’incorporation de cellules dans le collagène ou la matrice de la membrane basale, remettre en suspension dans un volume de 7 mL par pancréas. En cas d’infection adénovirale ou lentivirale, remettre en suspension dans 4 mL par pancréas.
3. Infection virale
- Comme un pancréas suffit pour deux infections virales (contrôle et expérimentale, par exemple, null et cre), répartissez la suspension cellulaire entre les couvercles de deux plaques de 35 mm. L’utilisation du couvercle des plaques permet l’infection en suspension et donc un déplacement facile sur le substrat final plus tard.
- Lorsque vous travaillez avec des virus, faites tremper toutes les pointes de pipette utilisées dans de l’eau de Javel à 10 % pendant au moins 15 minutes.
note: L’utilisation des plaques de 35 mm et du volume de 4 ml fonctionne bien pour les cellules de souris non transgéniques âgées de 8 à 16 semaines. Il peut être nécessaire d’ajuster la taille et le volume de la plaque pour les animaux ayant un pancréas plus petit ou plus grand.
- En cas d’infection adénovirale, ajouter le virus (avec un titre d’au moins 107 UT/mL) à une dilution de 1:1 000 sur le couvercle de chaque plaque et agiter (figure 1, adénovirus GFP). Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % de CO2) et remuez toutes les 15 minutes pendant 1 h. Poursuivez l’incubation pendant 2 h supplémentaires, puis procédez à l’intégration des cellules dans le collagène ou la matrice de la membrane basale.
- Après avoir terminé le travail viral dans la hotte, trempez tous les composants de la cagoule avec de l’eau de Javel à 10 % pendant au moins 15 minutes, puis nettoyez soigneusement l’eau de Javel avec de l’éthanol à 70 %.
4. Intégration des cellules dans le collagène ou la matrice de membrane basale
- Fabriquez du gel de collagène sur glace en combinant 7 ml de collagène de queue de rat de type I (3,3 mg/mL), 700 μL de milieu 10x Waymouth et 466,6 μL de 0,34 M NaOH.
- En prenant des volumes égaux de gel de collagène et de suspension cellulaire, mélangez doucement. Si vous ajoutez un stimulus ou un inhibiteur, combinez-le avec la suspension de cellules de collagène. Plaquez un puits à la fois (plaques de l’étape 1.5.3) ; En gardant la plaque sur de la glace, remuez pour répartir uniformément la couche de cellules de collagène.
- Dans chaque puits, pipetez les volumes suivants de suspension de cellules de collagène : 200 μL (lame de verre à 8 puits), 500 μL (plaque à 24 puits), 1000 μL (plaque à 12 puits) ou 2000 μL (plaque à 6 puits). Notez que l’ADM est induite par stimulation avec du TGF-α (50 ng/mL) dans la figure 1.
- Pour l’intégration de cellules dans la matrice de membrane basale, mélangez une matrice de membrane basale en une partie avec une suspension de cellules en deux parties. Comme pour le collagène, conservez la suspension matricielle-cellule ainsi que la plaque sur de la glace. Pipetez un puits à la fois en utilisant les mêmes volumes que ceux indiqués à la section 4.2.1 et tournez pour une distribution uniforme.
- Placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2) pendant 30 minutes pour la solidifier, puis ajoutez 1 milieu complet de Waymouth avec n'importe quel stimulus ou inhibiteur (la figure 1 utilise du TGF-α à 50 ng/mL). Changez de milieu (avec stimulus ou inhibiteur) le lendemain, puis tous les deux jours. Selon le stimulus, l’ADM peut être observée entre le jour 3 et le jour 5.
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