Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
Les outils chirurgicaux nécessaires sont illustrés à la figure 1 et le schéma de la procédure est illustré à la figure 2.
1. Solutions
- Préparez la solution saline équilibrée de Hank’s en ajoutant 100 ml de 10X HBSS (du bouillon) à 900 ml d’eau distillée pour obtenir 1 L de HBSS (1X).
- Préparez la solution STOP (qui doit être fraîche et doit être utilisée dans l’heure) en ajoutant 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS) 100X à 450 mL de HBSS 1X glacé, ce qui donne 500 mL de solution STOP. Maintenir la solution STOP à 4 °C.
- Préparez une solution de collagénase P (qui doit être fraîche dans l’heure suivant l’utilisation) en ajoutant 1 mg/mL de collagénase P à du 1X HBSS glacé ; utilisez 6 mL/souris.
- Ajouter 0,05 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) à la solution de collagénase P (cela fournit des nutriments aux îlots isolés). Par exemple, utilisez 3 mg de BSA dans une solution de collagénase P de 6 ml. Gardez sur la glace.
- Calculez et préparez la quantité de collagénase P nécessaire pour toutes les souris dans un tube de 50 ml.
- Préparez le milieu complet du RPMI 1640 en ajoutant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, un supplément de cellules INS-1 (10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium et 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol) à 500 mL de milieu RPMI 1640 contenant 5,5 mM de glucose à utiliser pour la culture de nuit et l’incubation.
2. Préparation
- Remplissez trois tubes de 50 mL de solution inhibitrice de RNase, d’éthanol à 70 % ou de H2O distillé. Ces solutions seront utilisées pour le nettoyage des outils chirurgicaux avant et pendant l’intervention.
- Faites tremper les pointes des outils dans une solution inhibitrice de RNase pendant 30 minutes avant de commencer le protocole, ce qui élimine toute RNase potentielle sur les outils.
- Coussinets absorbants prédécoupés de 6 po x 6 po pour une utilisation pendant la chirurgie.
- Préparez à l’avance une solution 1X HBSS et conservez-la à 4 °C. Préparez la solution STOP avant l’opération. Conserver à 4 °C.
- Préparez la solution de collagénase P immédiatement avant l’opération et conservez-la sur de la glace.
note: Il doit être utilisé dans les 2 h suivant la préparation.
- Étiquetez les tubes de 50 ml pour la digestion et la purification ; préparez 2 tubes pour chaque souris, un pour la digestion et l’autre pour la purification des îlots de Langerhans. Assurez-vous que l’identification de l’animal se trouve sur les deux tubes.
- Ajouter 3 mL de solution de collagénase P dans le premier tube de 50 mL. Les 3 ml restants de collagénase P seront injectés.
- Prélever les 3 ml restants de la solution de collagénase dans une seringue de 3 ml munie d’une aiguille de 30 g 1/2 po. Placez la seringue sur de la glace.
3. Procédure
- Retirez tous les outils de la solution inhibitrice de RNase, puis trempez-les d’abord dans le tube contenant de l’éthanol à 70 %, puis dans le tube contenant du H2O distillé, puis séchez à l’air libre sur une serviette en papier propre.
- Placez la souris dans une chambre contenant 0,5 mL d’isoflurane jusqu’à ce que la souris soit profondément anesthésiée.
- Retirez la souris de la chambre et vérifiez l’état de l’anesthésie en pinçant un coussinet plantaire avec une pince. L’anesthésie profonde est basée sur l’observation que la respiration devient progressivement lente et que la souris ne réagit pas au pincement du pied. Après avoir confirmé que la souris est profondément anesthésiée, euthanasiez-la avec une luxation cervicale, puis placez la souris sur le tampon absorbant.
- Placez la souris anesthésiée sur son ventre, en appliquant une pression sur le cou et en disloquant la colonne vertébrale du cerveau en tirant sur la queue.
- Collez les membres de la souris en position couchée sur le tampon absorbant, vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70 % et essuyez l’excès d’éthanol.
- Utilisez des pinces en verre de couverture et des ciseaux chirurgicaux incurvés pour faire des incisions. Faites d’abord une incision horizontale sur la peau de la région abdominale (~3 cm), ouvrez grand la peau pour exposer la paroi abdominale. Faites ensuite une incision verticale (~3 à 4 cm) sur le péritoine abdominal pour exposer complètement le pancréas dans la cavité abdominale (Figure 3).
- Poussez les lobes du foie vers le haut pour exposer le canal biliaire, il apparaîtra comme un tube rose pâle (Figure 3).
- Déplacez avec précaution les intestins de la région lombaire/iliaque droite de la cavité abdominale vers la droite, en exposant le canal biliaire et l’artère hépatique (Figure 3).
- Clampez soigneusement le canal cholédoque à l’aide des micro-serrefines Schwartz (Figure 1) aussi près que possible du foie.
- Identifiez l’ampoule de Vater, qui est située au niveau de la papille duodénale, formée par l’union du canal pancréatique et du canal cholédoque. L’ampoule de Vater semble enflée lorsqu’elle est observée au microscope de dissection, qui est le point d’entrée du canal cholédoque (Figure 4).
note: Le réglage de l’intensité et de l’angle de la lumière du microscope de dissection peut faciliter sa localisation.
- Insérez la seringue avec 3 mL de la solution de collagénase P dans l’ampoule de Vater. Enfoncez l’aiguille dans le canal sur environ 1/4 de la longueur du canal cholédoque (l’ampoule mène dans le canal) comme illustré à la figure 5.
- Une fois que l’aiguille est dans l’ampoule, assurez-vous que l’orientation de l’aiguille est telle qu’elle soit parallèle au conduit.
- Stabiliser l’aiguille en la serrant à l’aide d’une micro pince Adson pour éviter qu’elle ne perce le conduit (Figure 5).
- Injectez lentement et régulièrement 3 ml de la solution de collagénase P de la seringue dans le canal cholédoque (suffisamment pour ressentir une résistance), comme le montre la figure 6. Le but est de créer une pression de refoulement pour forcer la collagénase à pénétrer dans le canal pancréatique. L’injection est considérée comme réussie si la tête, le cou, le corps et la région de la queue du pancréas sont tous complètement gonflés.
note: Le rendement des îlots sera faible si le pancréas n’est pas complètement gonflé ou si la zone splénique n’est pas complètement gonflée. La zone splénique contient le plus grand nombre d’îlots6. Le gonflement peut être confirmé par l’apparition d’espaces ouverts entre le tissu pancréatique qui sont remplis de solution.
- Disséquez soigneusement le pancréas gonflé et placez-le dans un tube de digestion de 50 ml contenant 3 ml de solution glacée de collagénase P.
- Retirez le pancréas à l’aide de 2 pinces (incurvées et Micro Adson ; Voir Figure 1) : (en partant de la rate, retirez le pancréas de la rate et continuez à le retirer de l’estomac et le long du duodénum.
note: Aucune incision n’est requise.
- Hachez le pancréas pendant 3 à 5 secondes dans le tube digestif avec 3 ml de solution glacée de collagénase P à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins (figure 7A).
- Fixez le tube sur une grille au bain-marie à 37 °C et agitez à 100-120 tr/min pendant environ 12-13 min.
- Après l’incubation, secouez doucement les tubes à la main pour perturber le tissu jusqu’à ce que la solution de digestion de la collagénase P devienne homogène (Figure 7B). L’homogénéité est confirmée par un aspect sablonneux de fines particules de pancréas. Environ 30 secondes de poignée de main douce suffisent généralement. Tenez le tube à la lumière pour examiner si le tissu est bien homogénéisé ; Agiter encore ~15 s si nécessaire.
- Une fois digérés, placez immédiatement les tubes sur de la glace et ajoutez 40 mL de solution STOP glacée pour terminer la digestion enzymatique.
note: À ce stade, les tubes de digestion peuvent être laissés sur de la glace jusqu’à 2 h, si vous travaillez sur plusieurs souris.
- Centrifuger le tube dans une centrifugeuse à godets oscillants à 300 x g pendant 30 s (la température de la centrifugeuse est flexible).
note: Utiliser une centrifugeuse à seau oscillant de manière à ce que la pastille de tissu se forme au fond du tube de 50 mL et non sur la paroi du tube ; Ceci est essentiel pour un meilleur rendement des îlots.
- Décantez et répétez la centrifugation avec la solution STOP 2 fois de plus, en décantant la solution après chaque essorage. Utilisez 20 ml de solution STOP pour chaque lavage subséquent.
- Avant chaque essorage, perturbez la pastille en secouant doucement la pastille de tissu dans le tube de 50 mL dans une solution STOP de 20 mL.
- Remettre la pastille de tissu en suspension avec 40 mL de HBSS glacé et centrifuger à 300 x g pendant 30 s.
- Décanter et répéter la centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse à godets oscillants avec la solution HBSS deux fois de plus, en décantant la solution après chaque essorage. Utilisez 20 ml de HBSS pour chaque lavage.
- Avant chaque essorage, débrouillez la pastille, pour la détacher du fond du tube en secouant doucement le tube contenant 20 mL de solution HBSS.
- Après la dernière centrifugation, retirez tous les HBSS.
- Ajoutez ensuite 5 ml de gradient de densité à température ambiante dans le tube de 50 ml contenant la pastille. Vortex brièvement à basse vitesse jusqu’à homogénéisation.
- Ajouter 5 mL supplémentaires du gradient de densité de température ambiante dans le tube de 50 mL. Ne pas vortex/mélanger.
note: Il est essentiel de rester stable et immobile afin de permettre à un meilleur gradient de se former sans interruption.
- Pipeter 10 mL de tampon HBSS à température ambiante dans le tube (contenant le gradient de densité), goutte à goutte doucement et lentement pour permettre à un gradient de se former. Utilisez un pistolet pipette avec une pipette de 10 mL pour ajouter HBSS goutte à goutte.
- À l’aide d’une centrifugeuse à godet oscillant, faites tourner les tubes à 1700 x g pendant 15 min. Assurez-vous de régler la vitesse de l’accélération et de la décélération sur le réglage le plus bas pour maintenir la pente (figure 7C).
- Après l’essorage, retirez délicatement les tubes sans perturber la pente. À l’aide d’un pistolet pipette pré-humidifié avec du HBSS froid (pipette HBSS de haut en bas), pipetez la couche d’îlots (5 à 10 ml) formée entre le gradient de densité et le HBSS dans le nouveau tube de collecte d’îlots de 50 ml.
note: Il est utile de mouiller la pipette avec du HBSS froid avant de pipeter les îlots afin d’éviter que les îlots ne collent aux parois internes de la pipette.
- Dans le cas où la séparation est incomplète, les îlots seraient visibles dans la couche de gradient de densité, pipeter la totalité des 10 ml du gradient de densité (couche inférieure) ainsi que la couche d’îlots formée à l’interface (pour laisser environ 8 à 10 ml de la couche supérieure HBSS derrière).
note: La collecte de la couche d’îlots et de la couche de gradient de densité (couche inférieure) peut entraîner l’accumulation de débris, ce qui peut allonger le temps de cueillette des îlots, mais aucune autre étape ne sera modifiée. Il n’est pas nécessaire de collecter ces deux couches lorsque la couche d’îlots est bien formée.
- Ajouter 20 mL de HBSS glacé dans le nouveau tube de 50 mL contenant les îlots, puis centrifuger à 350 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse à godet oscillant.
- Après l’essorage, pipeter soigneusement (ne pas transvaser) le surnageant (laisser ~3 mL au fond) sans déranger la pastille contenant les îlots au fond. Jetez le surnageant.
- Répétez le lavage et la centrifugation au moins 3 fois. Ajoutez 20 ml de HBSS à chaque fois et assurez-vous de suspendre la pastille avant chaque essorage.
- Réchauffez le flacon de média complet RPMI-1640 dans un bain-marie à 37 °C avant de l’utiliser. Après la dernière centrifugation, retirer tout le HBSS et ajouter 4 ml de milieu complet RPMI-1640 préalablement préparé (contenant du FBS, un supplément de cellules INS-1 et de la pénicilline/streptomycine) à la pastille.
- Délogez la pastille en tournant doucement le tube et versez immédiatement le média RPMI-1640 dans une boîte de Pétri de 100 mm. Ajoutez encore 5 ml de média RPMI-1640 dans le tube et agitez-le doucement pour laver tous les îlots restants, puis versez également le média dans la même boîte de Pétri.
- À l’aide d’un microscope de dissection, prélevez des îlots sains dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette de 20 μL et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 10 ml de milieu RPMI 1640 complet. Lorsqu’ils sont observés au microscope de dissection, les îlots doivent apparaître sphériques/oblongs et de couleur brun doré avec une surface lisse par rapport au tissu exocrine relativement transparent et vaporeux.
note: Le grossissement du microscope de dissection est généralement fixé à 12,5-16x. Le rendement des îlots varie en fonction de divers facteurs, notamment la souche, l’âge et le sexe de la souris. Ce protocole produit généralement 250 à 350 îlots sains à partir de souris C57BL/6J saines âgées de 4 à 10 mois.
- Incuber les îlots dans un incubateur stérile à 37 °C avec une infusion de 5 % de CO2 et d’air humidifié à 95 % pendant la nuit pour des expériences le lendemain, ou congeler les îlots pour l’analyse souhaitée plus tard.
- Une fois congelés, les îlots ne peuvent pas être utilisés pour les tests de sécrétion, mais seulement pour la quantification de l’ARN ou des protéines. Pour prélever les cellules à congeler, placez-les dans la mémoire tampon HBSS, rassemblez tous les îlots dans 200 à 500 μL de tampon, transférez-les dans un tube de 1,5 ml, centrifugez 350 x g pendant 1 à 2 minutes, retirez le surnageant en ne laissant pas plus de 30 à 40 μL de solution, placez-le à -20 °C pour un stockage à court terme (plusieurs jours) ou à -80 °C pour un stockage à long terme.
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