Coloration immunofluorescente des sphéroïdes : une technique pour analyser les sphéroïdes pour l’expression de l’expression intra- et extracellulaire de l’antigène

Résumé

Source : Cavaco, A. C. M. et al. Un modèle sphéroïde 3D comme système plus physiologique pour les études in vitro de différenciation et d’invasion des fibroblastes associés au cancer. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la technique de coloration immunofluorescente des sphéroïdes pour comprendre la différenciation des fibroblastes ou CAF. Ce protocole permet de détecter l’expression d’antigènes intra- et extracellulaires, y compris le dépôt de protéines ECM dans les sphéroïdes.

Protocole

1. Coloration immunofluorescente des sphéroïdes

1. Prélever les sphéroïdes après environ 24 h dans un tube de réaction de 1,5 mL par condition expérimentale ou par protéine à analyser. Par exemple, placez les sphéroïdes d’iNFs stimulés par le TGF-β1 dans un tube différent des iNFs témoins, qui n’ont pas été traités. Pour éviter la rupture des sphéroïdes due à des forces de cisaillement trop fortes, coupez l’extrémité de la pointe de la pipette pour agrandir l’orifice. Incluez au moins 5 à 10 sphéroïdes dans un tube de réaction, pour permettre les réplications et prendre en compte les pertes possibles lors des étapes de lavage.
2. Centrifuger les sphéroïdes à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pendant environ 30 à 60 s à 1 000 x g. Retirer avec précaution le surnageant contenant de la méthylcellulose par pipetage, sans déranger les sphéroïdes granulés.
3. Laver avec 50 μL de 1x PBS. Répétez l’étape de centrifugation et retirez soigneusement le PBS par pipetage, comme décrit au point 1.2.
4. En fonction de la protéine à colorer, fixer avec 50 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante (pour αSMA, NG2 et intégrine α3β1) ou avec 50 μL de méthanol pendant 10 min à -20 °C (pour les sous-unités de laminine-332).
5. Répétez l’étape de lavage comme expliqué aux étapes 1.2-1.3.
6. Perméabiliser les cellules avec 0,1 % de Triton-X dans du PBS pendant 4 min à température ambiante.
7. Répétez l’étape de lavage comme expliqué aux étapes 1.2-1.3 trois fois.
8. Incuber les sphéroïdes dans du PBS contenant 5 % de FBS et 2 % de BSA, pendant 1 h à RT pour bloquer les sites d’interaction protéique non spécifiques.
9. Incuber les sphéroïdes avec 30 μL d’anticorps primaires dans du PBS, 2,5 % de FBS et 1 % de BSA à 4 °C pendant la nuit. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anti-αSMA conjugué Cy-3 et anti-NG2 à 5 μg/mL ; BM2 anti-laminine α3, 6F12 anti-laminine β3 et anti-laminine γ2 20 μg/mL.
10. Répétez l’étape de lavage comme expliqué aux étapes 1.2-1.3 trois fois.
11. Incuber les sphéroïdes avec 30 μL d’anticorps secondaires dans le PBS, 2,5 % de FBS et 1 % de BSA dans le RT pendant 90 min. Les anticorps secondaires suivants ont été utilisés : Alexa 488 anti-lapin et anti-souris (5 μg/mL).
12. Répétez l’étape de lavage comme expliqué aux étapes 1.2-1.3 trois fois.
13. Incuber les cellules avec 30 μL de solution de coloration DAPI pendant 4 min à température ambiante.
14. Répétez l’étape de lavage comme expliqué aux étapes 1.2-1.3.
15. Placez les sphéroïdes sur une lame de verre, dans une goutte de PBS, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
16. Imagez les sphéroïdes par microscopie à fluorescence dans un microscope à balayage laser en utilisant un grossissement de 10x. Prenez différentes sections optiques du sphéroïde à différents plans optiques d’un empilement z (15-20 plans d’empilement). Pour établir les paramètres du laser au microscope, utilisez un sphéroïde composé de cellules négatives pour l’antigène d’intérêt ou un sphéroïde coloré uniquement avec l’anticorps secondaire. Réutilisez les mêmes paramètres pour tous les échantillons qui seront comparés.
17. Analysez les images microscopiques avec le logiciel ImageJ tel que publié précédemment. Les étapes sont résumées à la figure 1. En arrière-plan, déterminez la densité de signal intégrée d’une région d’intérêt (ROI) sans cellule. Calculez la fluorescence cellulaire corrigée totale (TCCF) comme suit :
    TCCF = densité de signal intégrée - (aire du sphéroïde sélectionné x fluorescence moyenne du fond)
18. Déterminez la fluorescence totale corrigée (TCF) des sphéroïdes lorsque le TCCF est normalisé en fonction de la surface du sphéroïde et du nombre d’empilements.
    TCF = TCCF du sphéroïde / (aire des sphéroïdes x nombre de piles)

Résultats

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	Réf. D9542-10
6F12 anti-laminine β3 sous-unité souris (monoclonale)			fait maison
Albumine fraction V - BSA	AppliChem	A1391
Alexa fluor 488 Chèvre (polyclonale) anti-souris	Invitrogen	N° A11029
Alexa fluor 488 Chèvre (polyclonale) Lapin	Invitrogen	Réf. A11034
Souris anti-laminine γ2 sous-unité (monoclonale)	Santa Cruz	SC-28330
Centrifugeuse de banc	Fisher Scientific	Tél. : 50-589-620	germer
BM2 anti-laminine α3 sous-unité Souris (monoclonale)			Aimablement fourni par le Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Tubes à centrifuger 50 mL	Corning	Réf. 430290
Microscope confocal	Zeiss
DMEM (hyperglycémie 4,5 g/L)	Lonza	BE12-604F
Fibroblastes pancréatiques primaires humains	PELOBiotech	PB-H-6201
Pénicilline/streptomycine	Gibco	Référence 15140-122
Lames de microscope	Thermo Scientific	J1800AMNZ
paraformaldéhyde	Riedel-de Haën	Référence 16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS