Greffe de tumeur orthotopique par homogreffe : une technique pour générer des modèles murins de tumeurs pancréatiques

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation à la transplantation tumorale

1. Logement des animaux
   1. Procurez-vous des souris C57BL/6 génériques auprès d’un fournisseur de reproduction commerciale.
   2. Souris domestiques (5) dans des cages individuelles ventilées aux conditions suivantes : Température : 20–26 °C ; humidité 30–70 % ; cycle d’éclairage : 12 h de lumière et 12 h d’obscurité.
   3. Utilisez une litière d’épis de maïs qui est changée chaque semaine.
   4. Pour l’alimentation, fournir des granulés secs stérilisés par irradiation pendant toute la période d’étude.
   5. Pour l’eau, donnez aux animaux un accès gratuit à de l’eau potable stérile.
2. Préparation d’un fragment de tumeur donneur
   1. Commencez par surveiller le poids corporel (BW), par pesée à l’aide d’une balance, et le volume tumoral (TV), par mesure de l’étrier, des souris donneuses porteuses de tumeurs.
   2. Lorsque le téléviseur atteint 500 à 1 200 mm³, euthanasier l’animal dans une cagoule à risque biologique conformément au protocole.
   3. Stérilisez la peau autour de la tumeur à l’aide d’écouvillons d’iodophore.
   4. Enlever chirurgicalement la tumeur selon le protocole.
   5. Inspectez visuellement et par palpation la présence de tumeurs palpables avant l’arrêt.
   6. Pour l’élimination, euthanasiez d’abord les souris selon le protocole approuvé, ouvrez l’abdomen et examinez visuellement le pancréas à la recherche de tumeurs.
   7. Coupez la tumeur par chirurgie post-mortelle et ajoutez-la au PBS froid. Placez tous les animaux dans une chambre d’euthanasie propre, non chargée et translucide avec un couvercle spécial avec un orifice pour l’administration du dioxyde de carbone à utiliser.
   8. Évacuer le gaz dans la chambre à un débit qui produit une perte de conscience rapide avec un minimum de détresse pour l’animal. Le débit optimal de CO₂ doit être d’environ 2 à 2,5 L/min.
   9. Observez visuellement chaque animal pendant la procédure d’euthanasie pour vous assurer que tous les animaux reçoivent des concentrations de gaz adéquates et ne reprennent pas conscience pendant la procédure d’euthanasie.
   10. Maintenez le débit de gaz pendant au moins 1 minute après la mort clinique apparente pour minimiser la possibilité qu’un animal se rétablisse (s’il est apnéique mais n’est pas mort).
   11. Retirez les tissus non tumoraux adjacents. La tumeur nettoyée peut être photographiée rapidement.
       Mettez les tissus tumoraux dans le RPMI-1640 et conservez-les sur de la glace avant la dissociation.
       note: Les carcasses d’animaux sont mises en sac et entreposées dans le congélateur approprié en attendant d’être retirées.
   12. Placez la tumeur dans une boîte de Pétri contenant 20 ml de PBS (pré-refroidissez le milieu ou tamponnez à 4 °C avant d’euthanasier les animaux).
   13. S’il y a du sang contaminant, transférez la tumeur dans une autre boîte de Pétri et lavez la tumeur avec du PBS.
   14. Coupez la tumeur en deux, en enlevant toute peau supplémentaire, les vaisseaux, la calcification et/ou la nécrose.
   15. Choisissez uniquement des morceaux intacts de tumeur et placez-les dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml, puis ajoutez 20 ml de PBS, puis transportez le tube dans une salle animale séparée pour les études pharmacologiques.

2. Implantation orthotopique pancréatique

1. Anesthésie et analgésie
   1. Utiliser une injection de 2 mL de kétamine et 0,42 mL de xylazine injectable (20 mg/mL) mélangées à de l’eau d’injection stérile 5,91 ou à une solution saline à un volume de dose de 0,06 à 0,1 mL/20 à 25 g de poids corporel.
      REMARQUE : Selon le bien-être animal, l’analgésie est nécessaire avant et après l’opération. 0,05 à 0,1 mg de buprénorphine/kg, SC. La première dose est avant l’opération, puis dosée 3 fois toutes les 4 heures après l’opération en continu.
2. Opération chirurgicale pour implantation orthotopique
   1. Anesthésie des souris par injection intramusculaire (IM). Anesthésier l’animal receveur avec de l’isoflurane à 5 %, qui est maintenu par un cône nasal à 1 %. L’animal commencera à se détendre, perdra son réflexe de redressement et finira par devenir immobile. À cette profondeur d’anesthésie, ils peuvent facilement être réveillés par des stimuli douloureux ; Laissez l’anesthésie s’approfondir jusqu’à ce que de telles réponses à la douleur disparaissent.
   2. Une fois que les animaux sont complètement anesthésiés, fixez les souris sur un tableau d’expérience dans la position latérale droite.
   3. Gardez les souris dans la bonne position latérale. Désinfectez la peau autour de la rate avec de l’iode puis déiodez avec de l’alcool éthylique à 75 %.
   4. Trouvez le point moyen de la rate et faites une incision verticale de 1 cm sur l’abdomen pour exposer la rate.
   5. Prélevez doucement une partie du tissu pancréatique sous la rate à l’aide d’une pince à épiler à bout plat et suturez un morceau de tumeur d’homogreffe de souris à partir d’une souris graine sur le pancréas d’une souris receveuse par une suture chirurgicale résorbable 9-0.
   6. Fermez l’abdomen avec une suture en soie 6-0 par double couture. Atteindre l’homéostasie par compression.
   7. Après avoir terminé l’implantation de la tumeur, si aucun saignement ni fuite de tissu tumoral ne se produit, gardez les animaux dans une cage chaude.
   8. Surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal ; ramener l’animal dans la salle animalière après s’être complètement remis de l’anesthésie. Surveillez les souris porteuses de tumeurs en palpant l’abdomen près de la rate et sélectionnez les souris porteuses de tumeurs orthotopiques.

3. Surveillance de la santé des souris porteuses de tumeurs

1. Vérifiez quotidiennement la consommation d’eau et de nourriture.
2. Examinez l’apparence de la souris pour un pelage non toiletté, des bosses, de la minceur, une haleine anormale ou une ascite.
3. Palper l’abdomen pour vérifier s’il y a des tumeurs spontanées sur le foie ou la rate.
4. Pesez les souris chaque semaine à l’aide d’une balance.
5. Si l’un des signes cliniques suivants est observé, les souris sont sacrifiées pour le prélèvement d’échantillons et la nécropsie : perte de poids corporel >20 %; mobilité réduite (incapable de manger ou de boire) ; incapacité de bouger normalement en raison d’une ascite importante et d’une hypertrophie abdominale ; effort respiratoire.