Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire jolive.
1. IRE des tumeurs SQ
- Préparez le matériel nécessaire : électroporateur à ondes carrées, pédale de sécurité, électrodes (réseau d’aiguilles ou pince à épiler) et adaptateurs. Gardez à proximité des sutures stériles (non résorbables 4-0), des tampons imbibés d’alcool, des tondeuses à cheveux, de la crème dépilatoire, du lubrifiant pour les yeux, de la gaze de coton, de la buprénorphine et des anesthésiques.
- Stérilisez la pince à épiler ou les électrodes à aiguille à l’aide de la stérilisation au gaz. L’autoclave n’est pas recommandé. Utilisez un stérilisateur à billes de verre pour stériliser les électrodes entre les animaux.
- Suivez les étapes pour induire avec succès l’anesthésie chez la souris une fois que l’implant tumoral SQ atteint 5 mm de diamètre. En bref, administrer à la souris receveuse 0,05 à 1 mg/kg d’analgésique buprénorphine SQ, 30 minutes avant la chirurgie. Ensuite, anesthésez les souris receveuses avec 2 à 3 % d’isoflurane dans de l’oxygène (2 L/min) à l’aide d’un vaporisateur de précision (ou d’autres agents anesthésiques). Gardez les souris sur un coussin chauffant à 37 °C pendant toute la durée de la procédure. Appliquez du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation. Testez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de sursaut au départ, et confirmez l’anesthésie du plan chirurgical par l’absence de réflexe de pédale à un léger pincement des orteils. Maintenez l’anesthésie pendant toute la durée de l’intervention chirurgicale.
- Placez la souris anesthésiée sur le côté pour accéder à la tumeur SQ sur le flanc. Retirez les poils à l’aide d’une tondeuse et nettoyez la peau à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.
- Pour les tumeurs SQ, utilisez des électrodes à 2 aiguilles. Élevez la peau directement sous le site de la tumeur à l’aide d’une pince et insérez les électrodes à travers la peau parallèlement au corps en vous assurant qu’elles ne pénètrent pas dans la cavité péritonéale. Une fois à travers la peau, positionnez les électrodes de manière à ce qu’elles encadrent la tumeur.
- Programmez l’électroporateur pour qu’il délivre des impulsions de 100 μs à une fréquence de 1 Hz à 1 500 V/cm pour un total de 150 impulsions. Délivrez les impulsions à l’aide de la pédale. Séparez chaque série de 10 impulsions par 10 s, afin de permettre la dissipation de la chaleur et de confirmer la position correcte des électrodes.
note: Sans l’utilisation d’agents paralysants, les souris subiront des contractions musculaires avec IRE qui peuvent provoquer le déplacement des électrodes à moins d’être fixées manuellement.
- Retirez les électrodes après un dosage complet, qui ne doit pas dépasser 200 s. Enregistrez la tension réelle délivrée, qui s’affiche sur l’électroporateur. Laissez les souris se rétablir après l’IRE dans leur cage domestique avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Placez la cage sur un coussin chauffant pour faciliter la récupération. Surveillez les signes vitaux tels que la respiration, la perfusion, etc., pendant le processus de récupération. Confirmez les signes de réflexe de redressement une fois que la souris se rétablit, puis remettez la cage dans son logement normal. Administrer de la buprénorphine 0,05 à 0,1 mg/kg de 8 à 12 h après la chirurgie et toutes les 8 à 12 h après la procédure, au besoin, pour détecter les signes de douleur.
2. IRE des tumeurs orthotopiques
NOTE : L’IRE des tumeurs orthotopiques implique une seconde chirurgie de survie sur la même souris, nécessitant donc une approbation spéciale de l’IACUC local avant de commencer.
- Préparez le matériel requis : autoclavez les outils chirurgicaux tels que les ciseaux, les scalpels, les tourne-aiguilles, les pinces pointues et les pinces à pointe plate. Gardez également à portée de main les éléments suivants : sutures stériles (résorbables 6-0 et non résorbables 4-0), tampons imbibés d’alcool, tondeuses à cheveux, crème dépilatoire, lubrifiant pour les yeux, gaze de coton, solution de povidone iodée à 10 %, champs chirurgicaux, coussins chauffants, électroporateur à ondes carrées, pédale de sécurité, électrodes et leurs adaptateurs, buprénorphine et anesthésiques.
- Évaluez la croissance tumorale orthotopique chez les souris par imagerie de bioluminescence in vivo. Suivez la croissance tumorale par imagerie à partir du 4e jour après l’implantation orthotopique et effectuez l’imagerie deux fois par semaine. Le jour de l’imagerie, administrer (injection intrapéritonéale) 30 mg/kg de D-luciférine à une souris receveuse anesthésiée (2 à 3 % d’isoflurane dans l’oxygène [2 L/min]) 10 min avant l’imagerie. Image de l’activité de la luciférase à l’aide du réglage de luminescence sans aucun filtre d’émission pour une exposition minimale de 5 s dans un imageur de luminescence avec platine chauffée sans auto-fluorescence et tout en maintenant l’anesthésie pour les souris.
note: Les tumeurs orthotopiques sont idéales pour le traitement IRE 8 à 10 jours après l’implantation, lorsque les tumeurs sont clairement visibles et toujours confinées au pancréas, comme on peut le voir sur les images de luminescence de la luciférase
- Suivez les étapes pour localiser la tumeur implantée. En bref, administrer à la souris receveuse 0,05 à 1 mg/kg d’analgésique buprénorphine SQ, 30 minutes avant la chirurgie. Anesthésie les souris receveuses avec 2 à 3 % d’isoflurane dans de l’oxygène (2 L/min) à l’aide d’un vaporisateur de précision (ou d’autres agents anesthésiques). Gardez les souris sur un coussin chauffant à 37 °C pendant toute la durée de la procédure. Appliquez du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation. Testez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de sursaut au départ, et confirmez l’anesthésie du plan chirurgical par l’absence de réflexe de pédale à un léger pincement des orteils. Maintenez l’anesthésie pendant toute la durée de l’intervention chirurgicale. Placez la souris sur son dos et tournez-la doucement vers son côté droit afin que le côté gauche de l’abdomen soit exposé. Retirez les poils abdominaux de la souris à l’aide d’une crème dépilatoire et nettoyez-les avec de la gaze pour vous assurer qu’aucun cheveu libre ne pénètre dans l’abdomen après l’incision. Préparez l’abdomen gauche pour la chirurgie à l’aide de 3 cycles de povidone iodée à 10 % suivis de lingettes imbibées d’alcool pour désinfecter la peau. À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision transversale ou oblique de 1,5 cm dans la peau, à 1 cm à gauche de la ligne médiane, sous la cage thoracique, légèrement médiale à la rate. Ensuite, étendez l’incision à travers la musculature abdominale, en reflétant l’incision superficielle sus-jacente. Localisez la rate à l’aide d’une pince à pointe plate et extériorisez-la doucement de la cavité abdominale. Rétractez la rate à l’aide d’un applicateur en coton stérile et trouvez la queue du pancréas attachée au bas de la rate. À l’aide d’une pince à bout plat, rétractez la queue du pancréas latéralement. Si la tumeur n’est pas facile à localiser, utilisez une pince à nez émoussé pour déplacer doucement l’estomac et la rate afin d’identifier la tumeur.
- Extériorisez la tumeur à l’aide d’une pince à nez émoussé et capturez fermement la tumeur avec les électrodes en platine de la pince à épiler. Délivrez les impulsions d’électroporation comme programmé à l’étape 1.7 à l’aide de l’électroporateur à ondes carrées par séries de 10 impulsions contrôlées par la pédale de commande.
- Gardez la tumeur extériorisée pendant au moins 60 secondes après l’IRE pour surveiller tout signe d’hémorragie. Réinsérez la tumeur dans la cavité abdominale et fermez l’incision comme décrit. Brièvement, fermez la musculature abdominale à l’aide d’une suture résorbable 6-0 avec un point continu ou interrompu, et fermez la peau sus-jacente à l’aide d’une suture interrompue non résorbable 3-0 à 6-0. Arrêtez l’anesthésie à ce stade. Laissez la souris récupérer comme décrit à la section 1.7. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle récupère.
- Surveiller les effets de l’IRE sur la croissance tumorale à l’aide de l’imagerie luciférase in vivo conformément à l’étape 2.2.
