Co-cultures de sphéroïdes 3D bio-imprimées magnétiquement : une méthode de co-culture de cellules cancéreuses et de fibroblastes

Résumé

Source : Noel P. et al.Préparation et dosage métabolique de co-cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses du pancréas et de fibroblastes. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo explique la bio-impression magnétique 3D de cellules cancéreuses du pancréas et de fibroblastes co-cultivés. Les cellules cancéreuses du pancréas et les cellules de fibroblastes pancréatiques activées sont co-cultivées et magnétisées à l’aide d’un assemblage de nanoparticules biocompatibles, pour générer des sphéroïdes, sous l’influence des forces magnétiques.

Protocole

1.Culture de sphéroïdes 3D du cancer du pancréas à l’aide de la bio-impression magnétique

1. À l’aide d’une technique standard de culture tissulaire aseptique, cultiver les cellules d’intérêt dans un ballon T75 jusqu’à une confluence de 70 à 80 % dans un milieu de croissance approprié.
   note: En règle générale, 5 à 7 × 10⁶ cellules d’une fiole T75 confluente à 70 à 80 % ont été récoltées. Deux types de cellules différents ont été utilisés dans cette étude - Patu8902 (cellules tumorales pancréatiques) et les cellules PS1 (cellules stellaires pancréatiques activées). Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans le milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 1× pénicilline-streptomycine (p/s).
2. Lavez les cellules une fois avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
3. Détachez les cellules de la surface du plastique en les testant avec 2 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 5 à 10 minutes à 37 °C. Vérifiez le détachement des cellules au microscope.
4. Désactiver la trypsine par l’ajout de 8 mL de milieu de croissance aux cellules détachées. Évitez la surtrypsinisation, car cela peut nuire à la santé et à la viabilité des cellules.
5. Pipetez les cellules vers le haut et vers le bas pour générer une suspension de cellule unique et comptez la densité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre.
6. Pendant ce temps, équilibrez un flacon de NS à la température ambiante.
7. Calculer la quantité de cellules nécessaires pour ensemencer le nombre désiré de sphéroïdes (puits) et aliquote dans un nouveau tube conique de 15 ml. Par exemple, pour ensemencer une plaque entière de 96 puits avec 5 000 cellules/puits, aliquote au moins 5,5 × 10⁵ cellules.
8. Prélever les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 3 min. Aspérer ou décanter soigneusement le surnageant et remettre les cellules en suspension à une concentration de 1,0 x 10⁶ cellules/mL dans un milieu de croissance. Pipeter doucement à l’aide d’une pointe de pipette large percée pour éviter le cisaillement. Par exemple, remettre en suspension 5,5 x 10⁵ cellules dans 550 μl de milieu de croissance.
9. Magnétisez la quantité souhaitée de cellules à l’aide du NS équilibré (étape 1.6).
   1. Ajouter directement le NS à la suspension cellulaire dans le milieu de croissance et agiter doucement. Pour un marquage magnétique efficace des piles, utilisez 10 μL NS par 100 μL de cellules (remises en suspension à 1 x 10⁶ cellules/mL).
      note: Pour une expérience typique, étiquetez 5,5×10⁵ cellules Patu8902 dans 550 μL avec 55 μL NS et 1,1×10⁶ cellules PS1 dans 1100 μL, (séparément) avec 110 μL NS.
   2. Retournez doucement le tube plusieurs fois pour assurer la suspension des cellules. Temporairement, transférez le mélange cellule-NS dans un seul puits d’une plaque de 24 puits. Faites-le séparément pour chaque type de cellule à magnétiser. Couvrir la plaque et incuber les cellules à température ambiante pendant 2 h en les secouant doucement pour permettre la liaison du NS à la surface de la cellule.
      note: La culture et le dosage de sphéroïdes à partir de cellules Patu8902 ou PS1 seules, en plus de la co-culture de sphéroïdes commençant avec les deux types de cellules prémélangés avant l’impression sur des lecteurs magnétiques, ont été réalisés avec succès en utilisant cette méthode dans des expériences indépendantes. Une méthode de génération de sphéroïdes de co-culture à partir de cellules Patu8902 et PS2 est décrite ci-dessous dans les étapes suivantes.
10. Effectuez doucement une pipette de haut en bas sur les cellules aimantées pour les mélanger uniformément et préparez un mélange principal contenant le nombre de cellules souhaité. Pour l’ensemencement de sphéroïdes, utilisez un total de 15 000 cellules (5 000 Patu8902 + 10 000 PS1) et ajustez à un volume total de 150 μL par puits d’une plaque de 96 puits.
    note: Le volume final distribué dans chaque puits doit être le même, quel que soit le nombre de cellules utilisées.
11. Placez une plaque répulsive cellulaire à 96 puits au sommet du sphéroïde magnétique à 96 puits et distribuez 150 μL de mélange cellulaire dans chaque puits. Observez les cellules se rassembler lentement vers le centre du puits au-dessus de l’aimant. Couvrir et incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur à 5 % de CO₂ réglé à 37 °C avec le sphéroïde magnétique toujours attaché. Retirez le moteur magnétique et incubez pour une croissance ultérieure jusqu’à 7 jours.
    note: Il est essentiel d’utiliser des plaques de croissance répulsives pour l’impression de sphéroïdes à l’aide de moteurs sphéroïdes magnétiques. Assurez-vous que l’entraînement sphéroïde avec des aimants plus fins et plus petits est utilisé, et non l’entraînement de maintien.
12. Surveillez la croissance des sphéroïdes tous les jours. Réapprovisionnez en milieu de croissance frais tous les trois jours en plaçant la plaque de croissance montée sur le moteur de maintien magnétique en biais et en utilisant une pipette multicanaux pour prélever le milieu épuisé.
    note: Les cellules Patu8902 et PS1 co-ensemencées à 15 000 cellules/puits se développeront en sphéroïdes 3D d’un diamètre de 400 à 600 μm en 5 à 7 jours. À ce stade, les sphéroïdes sont prêts pour la caractérisation métabolique, l’évaluation des médicaments et d’autres applications en aval.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % de trypsine EDTA	sigma	Référence 25300-054
Plaque répulsive cellulaire à 96 puits	États-Unis Scientific/ Griener Bio-One	Référence 655970	plaque de croissance sphéroïde
Cellométrie Lames de comptage cellulaire	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Entraînement sphéroïde magnétique n3D	Biosciences Nano3D	655841	Fait partie du kit de bio-impression Spheroid
n3D Sphéroïde magnétique holding conduire	Biosciences Nano3D	655841	Fait partie du kit de bio-impression Spheroid
n3D NanoShuttle-PL	Biosciences Nano3D	655841	Fait partie du kit de bio-impression Sphéroïde : conserver à 4 °C
Cellules Patu8902	Stock de laboratoire		Adénocarcinome canalaire pancréatique Cellules
Cellules PS1	Stock de laboratoire		cellules stellaires pancréatiques activées
RPMI1640	Gibco	Référence 11875-093	Milieux de croissance pour cellules, sphéroïdes