1. Dosage métabolique de sphéroïdes de tumeurs pancréatiques 3D pour les voies bioénergétiques à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire
REMARQUE : Dans cette section, l’analyse des fonctions métaboliques des sphéroïdes à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire avec des microplaques de dosage spécialement conçues pour les sphéroïdes 3D est décrite.
- Lavage et transfert de sphéroïdes des plaques de croissance aux microplaques de dosage des sphéroïdes.
note: Les sphéroïdes peuvent être utilisés pour des tests métaboliques lorsqu’ils atteignent un diamètre de ~500 μm.
- La veille de la réalisation de l’essai, hydrater la sonde ou la cartouche du capteur avec l’étalon d’essai (200 μL/puits) dans la plaque utilitaire fournie et incuber pendant une nuit (4 à 18 h) dans un incubateur humidifié (sans CO2) réglé à 37 °C.
- Préparez le milieu de test approprié pour le test métabolique souhaité en complétant le milieu de base (voir le tableau des matériaux) avec 2 mM de L-glutamine pour le test de stress de glycolyse (GST) ou avec 1 mM de pyruvate, 2 mM de L-glutamine et 10 mM de glucose pour un >note: L’analyseur de flux extracellulaire mesure à la fois la respiration mitochondriale (OCR) et la glycolyse (ECAR) de cellules vivantes dans un format de plaque à 96 puits. Ces taux donnent un aperçu de la fonction métabolique cellulaire dans les échantillons étudiés. Veuillez vous référer au manuel dans les kits de test pour des instructions détaillées.
- Après avoir ajouté des suppléments spécifiques au test (voir l’étape 1.1.1), réchauffez le milieu de test supplémenté dans un bain d’eau à 37 °C et ajustez le pH à 7,4 ± 0,1 avec du NaOH 0,1N. Gardez le moyen au chaud jusqu’à utilisation.
- Reconstituer les réactifs du kit de dosage dans le milieu de test calibré jusqu’aux concentrations de base recommandées.
note: Ceux-ci sont réalisés à 10× la concentration finale souhaitée dans les puits. Les concentrations de glucose, d’oligomycine et de 2-désoxy-glucose (2-DG) sont respectivement de 100 mM, 100 μM et 500 mM.
- Observer les sphéroïdes dans la plaque de croissance au microscope optique pour vérifier la morphologie et l’uniformité globale des sphéroïdes, en termes de forme et de structure des sphéroïdes.
- Transférez la plaque de croissance sur un entraînement de maintien magnétique et aspirez soigneusement le milieu de croissance de ~120 μL. Laver délicatement les sphéroïdes avec ~120 μL de milieu de dosage chauffé et pré-calibré, aspirer et répéter le lavage deux fois. Inspectez à nouveau les sphéroïdes au microscope pour vous assurer qu’ils ne sont pas emportés.
- Préparez la microplaque de dosage sphéroïde en ajoutant 180 μL de milieu de dosage chaud dans chaque puits.
- Réglez une micropipette P20 à 10 μL et ajustez-y une pointe large et percée. S’il n’est pas possible d’obtenir des pointes à alésage large, coupez les pointes des pointes de pipette ordinaires à l’aide de ciseaux propres ou d’un scalpel pour élargir l’alésage.
note: Cela devrait réduire le cisaillement et préserver la morphologie globale des sphéroïdes lors de leur transfert sur les plaques de dosage.
- Utilisez une surface chaude (37°C) pour effectuer le transfert des sphéroïdes. Utilisez une surface de visionneuse de film à rayons X chauffée par une lampe à lumière blanche pour améliorer le contraste et faciliter la visualisation des sphéroïdes pendant le processus de transfert.
- Aspirez soigneusement un seul sphéroïde prélavé de la plaque de croissance répulsive cellulaire à l’aide d’une micropipette P20 équipée d’une pointe à large alésage et transférez doucement le sphéroïde directement au centre de chaque puits d’une plaque de test de sphéroïde pour effectuer le test métabolique. Laisser chaque sphéroïde tomber doucement dans la micro-chambre centrale de chaque puits par gravité pure pour peupler la plaque de dosage.
note: Il faut généralement 5 à 8 s pour que chaque sphéroïde tombe au centre du puits par gravité. Ne retirez pas la pipette tant que les sphéroïdes ne se sont pas déposés dans la micro-chambre. Ne déposez pas de sphéroïdes dans les 4 puits d’angle de la plaque de dosage (A1, A12, H1, H12) car ceux-ci seront utilisés comme puits de fond.
- Surveillez la morphologie et la position de chaque sphéroïde pour vous assurer que chaque sphéroïde est au centre de chaque puits. Si nécessaire, repositionnez au centre du puits en aspirant le sphéroïde à l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, puis en déposant par gravité.
- Une fois que tous les sphéroïdes ont été transférés, placez la plaque de dosage dans un incubateur à air humidifié à 37 °C (sans CO2) pendant une heure avant le dosage.
- Chargement de la cartouche de capteur avec des composés et réalisation du test
- Préparez 10 × réactifs concentrés spécifiques à l’essai dans le milieu spécifique décrit à l’étape 1.1.2. Par exemple, pour effectuer la GST, reconstituez le glucose, l’oligomycine et la 2-DG dans les volumes recommandés mentionnés dans le manuel de dosage. Les dosages GST et MST ont été réalisés à l’aide de sphéroïdes Patu8902-PS1.
- Orientez correctement la cartouche de capteur avec les rangées étiquetées A-H sur le côté gauche et placez un guide de chargement sur le dessus de la cartouche de capteur. Assurez-vous du chargement correct du port souhaité en orientant le guide de chargement de manière à ce que la lettre correspondant au port à charger se trouve dans le coin supérieur gauche.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, distribuez les réactifs directement dans les orifices d’injection. Maintenez les guides de chargement en position du bout des doigts tout au long de la procédure.
note: Chaque réactif sera injecté dans un port recommandé référencé dans le manuel de dosage. Évitez de créer des bulles d’air, mais ne tapotez aucune partie de la cartouche pour éliminer les bulles d’air.
- Retirez le guide de chargement et placez-le au niveau des yeux avec la cartouche pour inspecter visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme.
- Créez le modèle de test expérimental/protocole d’instrument à l’aide du logiciel Wave du contrôleur d’instrument (ci-après, le logiciel d’analyse) comme décrit à la section 1.3.
- Conception et exécution du test à l’aide du logiciel d’analyse
- Créer un modèle de test pour l’expérience
- Ouvrez le logiciel d’analyse et cliquez sur « Modèles » ou choisissez parmi un modèle de test existant. Double-cliquez sur « Modèle vierge ».
- Définir des groupes et des conditions d’expérience.
- Définir des stratégies d’injection pour les ports A, B et C. Laisser le port D vide.
note: Pour le dosage GST, seuls ces ports seront chargés avec du glucose, de l’oligomycine et du 2-DG. En cas de dosage MST, l’oligomycine, le FCCP et la roténone seront chargés.
- Définir les prétraitements si les sphéroïdes ont été traités avec un ou plusieurs composés d’essai et le groupe témoin. Définissez le milieu de test pour inclure la source, les suppléments et d’autres informations.
- Définissez un ou plusieurs types de cellules (par exemple Patu8902, PS1) en voyant les informations de densité et de numéro de passage.
- Cliquez sur « Générer des groupes ».
- Cliquez sur l’onglet « Carte des plaques » et attribuez des groupes à la plaque d’essai correspondant au plan d’expérience.
- Sélectionnez les quatre puits d’angle comme puits d’arrière-plan. Assurez-vous qu’il n’y a pas de sphéroïdes dans ces puits.
- Exécuter le test sur l’analyseur
- Conservez les commandes de protocole par défaut en cochant « Étalonnage », « Équilibre » et « Cycle de mesure de base ».
- Cliquez sur « Injections » et définissez le composé pour chaque port. Modifiez les cycles de mesure à 6 cycles au lieu des 3 cycles par défaut pour les sphéroïdes. Conservez les durées par défaut de 3 min de mixage, 0 min d’attente et 3 min de mesure.
note: Les temps de mixage-attente-mesure par défaut sont respectivement de 3 min, 0 min et 3 min. Trois mesures du débit basal sont généralement prises avant l’injection du premier composé de dosage. Ces mesures peuvent être étalonnées et réajustées selon le plan d’expérience.
- Examiner le protocole et le résumé du groupe.
- Enregistrer le modèle de conception de test.
- Procéder à l’étalonnage préalable au test une fois que les ports d’injection ont été chargés avec les substrats de test. Transférez la cartouche avec la plaque utilitaire dans l’analyseur de flux extracellulaire.
note: Cela se termine généralement en 15 à 20 minutes et étalonne les capteurs pour effectuer des mesures OCR et ECAR.
- Après l’étalonnage de la cartouche, remplacez la plaque utilitaire par la plaque de test préchauffée contenant des sphéroïdes 3D et lancez le test. Une fois les mesures terminées, exportez les données vers un tableur ou un logiciel graphique et statistique pour analyser les données.
