Isolement de cellules souches PDAC : une méthode pour isoler des cellules souches cancéreuses de tumeurs pancréatiques

Résumé

Source : Lonardo, E., et al. Étude des caractéristiques des cellules souches du cancer du pancréas pour développer de nouvelles stratégies de traitement. J. Vis. Exp. (2015).

Cet article décrit la technique d’isolement des cellules souches du cancer du pancréas (CSC) du tissu de l’adénocarcinome canalaire pancréatique humain (PDAC). Ces CSC sont utilisés pour étudier les effets fonctionnels du traitement médicamenteux sur la capacité d’auto-renouvellement in vitro des CSC pour développer des traitements anticancéreux plus efficaces.

Protocole

1. Isolement des CSC de l’ACPE humain (Figure 1)

1. Dans une enceinte de biosécurité stérile, transvaser le tissu humain PDAC dans une boîte de culture de 60 x 15 mm contenant 1 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate 1X (PBS). Coupez la tumeur en petits morceaux (1 à 5 mm) à l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince.
2. Ajoutez 1 ml de PBS 1X stérile dans la boîte de culture et répétez l’étape de trituration jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié, régulièrement cela nécessite 3-4 tours. Transférez la suspension tissulaire (jusqu’à un volume final de 5 ml avec 1X PBS) dans un tube stérile et homogénéisez-la mécaniquement avec un dissociateur tel que gentleMACS.
3. Incuber le tissu homogénéisé avec de la collagénase (utiliser 2,5 mg/ml de collagénase dans 1X PBS) pendant 60 min à 37°C, puis centrifuger pendant 5 min à 900 x g. Décanter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 10 ml de milieu complet. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 μm et centrifuger pendant 5 min à 900 x g.
4. Décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec 5 ml de tampon de lyse des globules rouges (chlorure d’ammonium-potassium, ACK), puis incubez le
5. Remettre la pastille en suspension dans un milieu CSC, la déposer sur un plat recouvert de gélatine et l’incuber à 37°C pendant 1 h. Cette étape permettra d’éliminer la plupart des cellules fibroblastes qui se fixent rapidement à la plaque.
6. Retirer la plaque de l’incubateur et récupérer soigneusement la suspension cellulaire et quantifier le nombre de cellules viables (bleu trypan négatif) à l’aide d’un hémocytomètre. Pour ce faire, mélangez délicatement la suspension et pipetez 20 μl de la suspension dans un tube Eppendorf. Ajoutez 20 μl (rapport 1:1) de bleu trypan dans les cellules du tube de microcentrifugation et mélangez bien. Pipeter environ 10 μl du mélange sur l’hémocytomètre.
7. Comptez toutes les cellules claires dans les quatre quadrants d’angle de la chambre de comptage pour un comptage de cellules viables.
   note: La viabilité et le rendement des cellules peuvent varier considérablement entre les échantillons tumoraux. Pour les échantillons PDAC, la viabilité varie régulièrement entre 45 et 70 %, et les morceaux de tissu d’un échantillon de tumeur macroscopique d’un diamètre de 3 à 5 mm devraient donner environ 5x10⁶ cellules viables.

Résultats

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre de comptage/ Hémocytomètre	Hausser Scientific Co	3200
Compteur de cellules et analyseur CASY pour la mesure de la prolifération et de la viabilité	Roche Innovatis	AG CASY Modèle TTC 45,60,150 μm
Dissociateur GentleMACS	Miltenyi Co	Tél. : 130-093-235
Tubes GentleMACS C	Miltenyi Co	Tél. : 130-093-237
Boîtes de culture tissulaire de 100 mm	BD Faucon	353803
Passoire cellulaire	BD Faucon	Référence 352350
Tube conique en polypropylène de 15 ml	BD Faucon	352097
Tube conique en polypropylène de 50 ml	BD Faucon	Référence 352070
Tubes stériles de 1,5 ml	Eppendorf	Référence 0030 120.086
Tubes à centrifuger de 50 ml	Corning	430828
Boîtes de Pétri stériles, boîtes de 10 cm	Corning	353003
Collagénase de type IV	Technologies des cellules souches	Référence 7909
RPMI Moyen 1640	Technologies du vivant	Référence 11875-085
Solution de pénicilline/streptomycine, 100X	Technologies du vivant	SV30010
L-glutamine, 200 mM, 100X	Technologies du vivant	Référence 25030-081
Supplément B27 50x	Technologies du vivant	Référence 17504-044
Facteur de croissance des fibroblastes de base	sigma	Réf. F0291
Aigle modifié de Dulbecco moyen/F12	sigma	D8437
Stérile 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	sigma	D8537
Bleu trypan	Technologies du vivant	Référence 15250-061
Incubateur avec apport de CO2
Micro ciseaux
Pince incurvée
Pince à échardes