Dosage de la formation de sphères : une méthode in vitro pour identifier les cellules souches du cancer du pancréas et dépister les thérapies

1.Dosage et analyse de la formation de sphères

1. Dosage de la formation de sphères et traitement à la metformine
   1. Prenez le nombre requis de cellules et ajoutez le volume approprié de milieu CSCs pour préparer une concentration cellulaire de 2 000 cellules/ml. Ne pas garder la suspension cellulaire sur de la glace pendant 1 h au plus et bien mélanger avant le placage.
   2. Ajoutez 500 μl de 1X PBS à la première et à la dernière rangée d’une plaque à 24 puits pour l’humidification afin d’aider à minimiser l’évaporation du fluide. Ensemencez les cellules dans des plaques de cellules à très faible fixation à une densité de 2 000 cellules par puits dans 1 ml de milieu de sphère tumorale (2 000 cellules/ml).
      note: Le nombre de cellules utilisées pour les tests de formation de sphères tumorales peut varier entre les types de tumeurs.
   3. Traiter au moins 4 puits avec un véhicule (témoin négatif) et 4 puits avec chaque traitement alloué, par exemple, 3 mM de metformine. Placez les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C et alimentez-les avec 5 % de CO₂ pendant une semaine.
      note: Le milieu ne doit pas être modifié afin de permettre la formation non perturbée de sphères tumorales, mais peut être complété quotidiennement par des facteurs de croissance car ils ne sont pas stables dans le milieu de culture.
   4. Tous les deux jours, ajoutez un traitement, par exemple 3 mM de metformine ou de véhicule à chacun des puits. Évaluez le nombre de sphères tumorales formées après 5 et/ou 7 jours à l’aide d’un compteur de cellules automatisé qui permet de compter les structures plus grandes (Figure 1).
      note: Seules les sphères tumorales d’au moins 40 μm doivent être prises en compte et peuvent être classées comme petites (40 - 80 μm) ou grandes (80 - 120 μm), respectivement. Les résultats peuvent être illustrés par le pourcentage de sphères tumorales divisé par le nombre initial de cellules ensemencées (par exemple, 2 000 cellules).
2. Passage en série de sphères tumorales de première génération
   1. Après 7 jours d’incubation, récoltez les sphères tumorales à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 μm et centrifugez-les pendant 5 min à 900 x g à RT.
   2. Dissociez la pastille des sphères tumorales en cellules uniques à l’aide de trypsine, puis élargissez à nouveau la suspension de cellules unicellulaires obtenue pendant 7 jours supplémentaires.

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