1. Isolement des neurones
Une fois la collecte d’extraits/surnageants terminée, poursuivez l’isolement des neurones.
- Pour les neurones DRG, prélever les DRG cervicales à lombaires des rats nouveau-nés entre le jour postnatal (P) 2 et 12 après la décapitation et la dissection stéréomicroscopique des DRG (Figure 1A). Afin d’avoir suffisamment de neurones DRG pour une plaque de 24 puits, collectez tous les DRG cervicales à lombaires d’un rat nouveau-né (soit 52 DRG) par plaque.
- Coupez les projections périphériques (neurales) et centrales (racines) de DRG à l’aide de microciseaux. Le fait de laisser les projections en place entrave la trituration et augmente le risque de contamination de la culture par les fibroblastes.
- Pour les neurones MP, coupez le mésentère de l’intestin grêle et enlevez manuellement et soigneusement la couche séromusculaire de l’intestin grêle (pour un protocole détaillé sur l’isolement des MP, figure 1B). Pour la MP, prélever le plexus de deux rats par plaque de 24 puits.
note: Essayez d’être aussi doux que possible afin d’éviter les déchirures de la couche séromusculaire car elles empêchent sa séparation réussie de l’intestin grêle.
- Prélever le DRG et la couche séromusculaire dans un milieu essentiel minimal (MEM) glacé fourni avec de la gentamicine (20 mg dans un milieu de 500 ml) et du métronidazole (2,5 mg dans un milieu de 500 ml).
- Après la collecte des DRG, incubez-les dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) fournie avec de la collagénase de type II pendant 20 à 30 min. Pour l’isolement des MP, incuber dans le type collagénase entre 1 et 3 heures, selon l’âge de l’animal (Figure 1C).
- Pour les MP, collectez les morceaux de MP en forme de filet sous un stéréomicroscope et transférez-les dans un MEM glacé.
- Triturez ensuite le DRG et le MP à l’aide de seringues de diamètre décroissant.
note: Une trituration excessive peut détruire les neurones, mais moins les cellules gliales.
- Une fois que le milieu contenant le DRG ou le MP est devenu trouble, centrifuger la suspension à 93,9 x g pendant 5 min, jeter le milieu et remettre en suspension dans le milieu neurobasal (complété par 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 0,5 mM de L-glutamine et 2 % de B-27).
- Comptez le nombre total de cellules (c’est-à-dire les neurones ET les cellules gliales) à l’aide d’un hémocytomètre.
note: Le nombre de cellules nécessaires dépend du paramètre de mesure. Pour quantifier la densité des neurites, il faut des cultures plus denses et donc un plus grand nombre de cellules que pour la mesure de l’excroissance des neurites, de la taille péricaryonale et du motif de ramification des neurones individuels. Pour les mesures de densité de neurites, utilisez par exemple 10 000 cellules (neurone + glie)/puits ou 1 500 neurones/puits. Pour la morphométrie sur des neurones individuels, une brève trypsinisation (d’une durée de 1 minute) des cellules et l’ensemencement de 2 500 cellules/puits ou 400 neurones/puits sont recommandés. Le rendement typique des cellules obtenues à partir d’un rat est d’environ 300 000 à 500 000 cellules.
- Ensemencer les cellules sur des lamelles de 13 mm qui ont été enduites la veille et garnir les puits de milieu neurobasal (complété par 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 0,5 mM de L-glutamine et 2 % de B-27) (Figure 1D).
note: Utiliser des lamelles enrobées de poly-D-lysine (40 mg/m2) OU d’ornithine et de laminine (1 mg/ml chacune). Les cellules se fixent extrêmement rapidement à la poly-D-lysine, ce qui la rend adaptée aux expériences dans lesquelles de nombreuses cellules sont nécessaires (c’est-à-dire les mesures de densité des neurites). L’attachement à la laminine est en général un peu plus faible, mais la laminine est un puissant promoteur de la croissance des neurites. Par conséquent, pour les mesures sur la ramification neuronale et la longueur des neurites, préférez l’enrobage ornithine/laminine.
- Laissez les cellules se fixer aux puits pendant la nuit. Le lendemain, préparez le milieu enrichi en extrait (à une concentration finale d’extrait/surnageant de 100 μg/ml).
- Aspirez le milieu d’ensemencement et effectuez un lavage facultatif très doux avec du PBS, puis pipetez lentement le milieu enrichi en extrait ou en surnageant (figure 1E).
- Laissez les cellules se développer pendant 48 heures. Aspirez le milieu et fixez-le à 4 % de paraformaldéhyde pour l’immunocoloration (Figure 1F).
- Effectuer une double coloration par immunofluorescence à l’aide de marqueurs spécifiques aux neurones (par exemple, bêta-III-tubuline) et spécifiques à la glie (par exemple, protéine acide fibrillaire gliale/GFAP) (Figure 1G).
- Pour la morphométrie, utilisez un microscope à lumière inversée équipé d’une caméra CCD en combinaison avec un logiciel automatisé qui permet de mesurer la densité des neurites (voir tableau).
- La densité neurite des cultures neuronales est mesurée sur 4 à 5 photomicrographies représentatives à un grossissement de 200x à partir de 4 régions différentes de croissance la plus dense sur chaque lamelle en superposant une grille de 50 μm x 50 μm et en comptant la densité de fibres par carré mesurée dans les fibres qui se croisent. L’excroissance des neurites, le nombre moyen de branches par neurone, la longueur moyenne des branches et la taille péricaryonale peuvent être mesurés à partir de 30 neurones solitaires sélectionnés au hasard dans chaque lamelle en marquant les neurites et le péricarya (Figure 1H).
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